葉綠體遺傳

葉綠體遺傳工程最適合表達高水平的疫苗抗原，生產治療性蛋白質。已經有幾種治療性蛋白質通過轉基因煙草的葉綠體表達，包括霍亂、炭疽熱、鼠疫和破傷風疫苗抗原，單克隆抗體，和其他的用在人身上的治療性蛋白質：人生長激素、人血清白蛋白、干擾素、類胰島素生長因子和抗菌蛋白等。然而，急需的還是利用基因工程方法生產口服的治療性蛋白質和疫苗抗原。口服制劑可以大大降低生產、純化、冷藏和運輸成本，並且能夠避免靜脈注射引起的併發症。

胡蘿蔔是表達治療性蛋白質的最佳選擇，因為整合轉基因質體的基因組通過母系遺傳，並且對於這個兩年生植物來説，在生長的第一年不開花即可收穫塊狀根。這兩個特徵使胡蘿蔔作為製藥作物不會對食用作物造成任何污染，符合各級管理機構的要求。胡蘿蔔體細胞胚胎來自於單個細胞，通過多級胚胎發生增殖而成，並且可以在體外培養保持數年；從而可以提供統一的細胞源，這對生產治療性蛋白質是必須的（來源統一）。胡蘿蔔細胞分裂速度快，用生物反應器能夠產生大量細胞。攜帶治療性蛋白質的胡蘿蔔細胞不需要進行任何烹飪，這樣在服用時可以更好的保護治療性蛋白質的完整性。利用人造種子技術，體細胞胚胎可以冷藏保存數年的時間。因此，攜帶藥性和增強營養水平的轉基因胡蘿蔔有至關重要的藥用價值，能夠大大提高人類的健康水平。然而必須説明的是，含有治療性蛋白質的新鮮蔬菜絕對不能直接口服，必須把細胞凍幹，包裝成膠囊，按計量服用。

轉基因可以在胡蘿蔔培養細胞的原質體中大量表達，與以前的報道相比，這是很大的突破。在以前的研究中，馬鈴薯莖中澱粉質體綠色熒光蛋白（GFP）的濃度不到葉子中的1%。胡蘿蔔培養細胞原質體和成色素體中BADH的活性分別是葉子葉綠體中的53.1%和74.8%。這項研究中使用的調控序列是16srRNA啓動子、T7基因10的5’非翻譯區、rps16的3’UTR，它們在所有的組織類型中都發揮功能，包括原質體、成色素體和葉綠體。這些研究結果表明，胡蘿蔔可以用來表達大量的疫苗抗原或其他治療性蛋白質，而且服用起來也更加方便。

棉花質體基因組的轉化

棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界上最重要的天然紡織纖維的來源，也是世界上最重要的經濟作物之一。美國的纖維產量佔世界的40%（年銷售額61億美元），是世界上原棉的主要輸出國之一。聯合國糧食農業組織（FAO）報告顯示，2003年棉紗布和棉籽等的產值入圍美國主要農產品20強。根據國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)統計顯示，美國經濟中與棉花相關的貿易每年為1,200億美元，棉花成為美國最有價值的農作物。然而，對棉花的體外基因操作非常困難，通過體細胞胚胎發生方式不容易產生植株。

2002~2003年，通過細胞核基因組工程改造的抗蟲和抗雜草的轉基因棉花的種植佔世界棉花種植的13%，而大豆是63%，玉米是19%。同期相比，美國77%的區域種植了基因改良（GM）棉花，而GM大豆是81%、GM玉米是40%。細胞核轉基因棉花只是在某些區域被限制的種植。陸地棉（Gossypiumhirsutum）和夏威夷棉（Gossypiumtomentosum）、弗羅裏達羣島的陸地棉野生種羣或者維爾京羣島和波多黎各陸地棉/海島棉在一塊都會產生雜交。因此，必須嚴格劃定一些區域進行轉基因試驗，在這些區域種植商業化的抗蟲棉花（Bt-cotton）。類似的，GM棉花也只能在特定的區域種植，避免使其與野生型親緣植物共存，防止遠源雜交形成親緣關係近的雜草。

有報道稱，轉基因棉花的花粉可以擴散到周圍非轉基因棉花上。Umbeck等人在研究花粉從轉基因棉花到傳統棉花區域的擴散問題時發現，儘管有緩衝帶隔離，它們之間仍有5.7%的互相雜交率。葉綠體基因工程可以避免轉基因棉花中的基因逃逸現象，因為葉綠體轉基因是通過母系遺傳的。對於表達Bt毒素的GM農作物，研究人員還關心另外一個問題，毒素沒有形成終產物，害蟲可能產生抗Bt的抗性。另外，利用細胞核基因工程產生抗蟲棉花對外源基因的表達量太低，不能有效保護植株不受害蟲的侵害，還必須結合其他幾種噴霧殺蟲劑進一步減少害蟲造成的損失。

Kumar等人最近證明，可以對棉花質體進行基因轉化，獲得穩定的母系轉基因遺傳。體外產生的轉基因棉花系與非轉基因的植株在栽培室中以相似的條件生長，葉綠體轉基因棉花和未基因轉化的棉花沒有任何區別，從初花、開花、結桃，到種子成熟，都沒有任何異常。F1子代十字雜交（非轉基因-轉基因）的種子能在卡那黴素選擇性培養基上發育，但是不能長大，而轉基因種子能夠抗卡那黴素正常的生長，長出很多的根和葉。這進一步證明了先前棉花葉綠體基因組不是通過父系或者雙親遺傳，而是通過母系進行遺傳的結論。葉綠體轉基因植株自授粉的種子可以在卡那黴素上生長，因此這些種子試驗是非孟德爾式遺傳。

大豆質體基因組的轉化

大豆（GlycinemaxL.Merr.）是豆科農作物，也是蛋白最主要的來源，是人類和動物最普遍的食物之一。幹大豆含大約20%的油和35~40%的高營養蛋白。大豆也是一個重要的GM農作物，GM大豆的種植佔2003年世界大豆種植的一半以上，農民願意種植這種草甘膦耐受的細胞核轉基因株。更多的工作致力於改造抗害蟲工程株，並提高抗病能力和油的質量。儘管尚無報道，如果利用大豆質體基因工程得到這些工程株，就會取消只能在特定區域內種植轉基因大豆的限制，因為大豆質體基因組同樣也是母系遺傳的。

組織培養是大多數植物基因轉化中至關重要的一步。因為能夠發育成完整植株，體外培養的大豆胚胎發生組織是點轟擊方法進行細胞核基因轉化的最常用材料。然而，像它的堅硬豆莢一樣，對大豆進行基因轉化仍然十分困難。大豆胚胎發生過程中未分化細胞僅包含少量的十分微小的質體，因此對大豆葉綠體進行基因轉化很困難。基因組數據庫中還沒有大豆質體基因組全序列，這也是大豆質體基因轉化的一個很大障礙。

Zhang等人首先嚐試進行大豆葉綠體的基因工程，他們希望提高大豆的光合作用能力。Dufourmantel等人最先利用體細胞胚胎發生方法成功實現大豆葉綠體基因工程，他們得到了可育的葉綠體轉基因植株。其轉化效率非常高，每次轟擊得到2個轉化，是馬鈴薯、西紅柿、擬南芥中葉綠體基因轉化效率的15~100倍。表型正常的轉基因植株可以通過體細胞胚胎發生得到。所有葉綠體轉基因植株都是完全可育的，並且其產生種子也可育。T1後代全部具有抗生素抗性，這説明轉基因是穩定的，並且是通過母系遺傳。

引入抗生素抗性基因，用細菌調控元件控制這個基因，這樣更容易被公眾接受。可以對大豆設計選擇性標記，如除草劑抗性基因或者BADH。但是，選擇性標記有其侷限性，除草劑抗性基因不能用來進行第一輪篩選，奇黴素選擇性對一些作物是致死的，棉花就是其中之一。BADH不能應用在內源的氨基乙酸三甲銨乙內酯表達量高的作物上。這裏只是提供了另外一個選擇，不同系統對標記的清除能力不同，取決於兩個直接重複間的同源重組，或者是位點特異重組系統，如Cre-Lox，或者是完全清除整合標記基因。

主要農作物中質體基因轉化成功的原因

雖然上述幾種農作物要進行基因轉化都非常困難，但是最近這些物種都獲得了高效質體基因轉化。馬鈴薯、西紅柿和油料作物Lesquerella葉綠體基因轉化的載體包含煙草或者擬南芥葉綠體的前後端序列，可能是導致這些農作物基因轉化效率低的原因。煙草質體基因轉化用的是自身的前後端序列，其效率非常高。用矮牽牛花的前後端序列進行煙草葉綠體基因轉化時，轉化效率急劇下降。其他幾個例子用的是非100%同源的質體DNA序列，質體基因轉化效率也非常低。因此，雖然萬能載體的概念已經提出幾年了，可以用來轉化幾個親緣關係近的作物（例如，煙草、西紅柿和馬鈴薯），但是還需要物種特異載體進行質體基因轉化，尤其是那些比較挑剔的物種。這樣的研究需要預先知道相關作物葉綠體的基因組序列。不幸的是，在已經發布的40多個葉綠體基因組和200多個正在測序物種中，只有6個是農作物葉綠體的基因組。

要了解和操作體細胞胚胎發生系統非常困難，利用異源質體組織繁殖，在隨後的循環中轉基因會失去優勢。在基因轉化過程中，非綠色組織中的原質體必須成為成熟的葉綠體，並且轉化細胞在發育的各個階段都必須承受選擇壓力。因此，最大困難是質體必須在有無光照的條件下都能夠承受選擇壓力，並且在發育的各個時期都是這樣。植物細胞經過轟擊後，形成一兩個成功基因轉化的葉綠體細胞，這一點尤為重要。必須依靠選擇壓力使基因轉化質體存活，而其他基因轉化失敗的質體在選擇壓力下會消失，相反，基因轉化質體不斷增殖並確立它們的優勢地位。

棉花質體基因轉化“雙槍”載體可以同時攜帶兩個基因，它們編碼兩種不同的蛋白質，共抗同一種或同一類毒物，其調控信號在原質體和成熟的葉綠體中都起作用。基因aphA-6和aphA-2(nptII)都編碼氨基葡糖苷磷酸轉移酶家族蛋白，但是它們起源於不同的原核生物。

兩種酶有着類似的催化活性，aphA-6的基因產物還能夠解毒卡那黴素，並且能對廣譜的氨基葡糖苷解毒，包括氨基羥丁基卡那黴素A。兩種轉基因(aphA2或nptII和aphA6)都被全長的質體Prrn啓動子轉錄，這個啓動子包含細胞核和質體編碼的兩種RNA多聚酶，因此可以認為它在原質體中和成熟葉綠體中都發揮作用。基因aphA-6也被T7基因10的5'UTR進一步調控，從而它能夠在黑暗的條件下，在非綠色組織的原質體中高效表達。rps16的3'UTR用來穩定基因aphA-6的轉錄。把T7基因10的5'UTR和rps16的3'UTR使BADH在胡蘿蔔葉子葉綠體中的表達升高看作100%，那麼在含有葉綠體的可食用的非綠色組織中的表達升高為74.8%（在地下黑暗的環境中），在原生質體中的表達升高為48%。因此可以認為，非綠色和綠色質體中的基因aphA6在有無光的條件下都會表達。

棉花質體基因轉化載體中的nptII基因被psbA5'和psbA3'UTRs驅動，已經多次證明這些序列以光依賴的方式對整合轉基因的質體表達進行調控。從而可以作出推測，卡那黴素在有光無光的條件下都會被降解。因此，aphA-6和aphA-2基因聯合在原質體和葉綠體中通過光信號進行調節，在選擇壓力存在的條件下持續對質體/葉綠體的轉化基因提供保護。利用單基因的調控序列，儘管轉基因在不同類型的質體中都能有效的表達，但是棉花的單個基因的轉化效率僅為5%，大大低於“雙槍”載體的42%。與之不同的是，光調節因子（rbcL5'UTR和psbA3'UTR）驅動的單個選擇標記基因（aadA）對大豆的質體基因轉化效率很高，因為轉化時轟擊的原始材料已經是綠色，含有成熟葉綠體，並且支持光合作用活性。

胡蘿蔔和棉花具有較高基因轉化效率可能還有一個原因，載體的前後端序列比較長，其中有葉綠體DNA的複製起始點，從而為轉基因整合提供更多的模板。例如，分別用具有oriA的葉綠體載體和沒有oriA的葉綠體載體轟擊培養的煙草細胞，只是那些有oriA的載體整合到trnI基因上，載體上的轉基因被表達，產生很高的氯黴素乙酰基轉移酶（CAT）活性。同樣用兩類葉綠體載體攜帶相同的基因分別轟擊細胞，具有oriA的載體整合到基因trnI的側序列，甚至可以在第一輪篩選中形成同型異源體。煙草葉綠體基因組的複製起始點已經被定位，oriA位於基因trnI中；基因trnI在棉花和胡蘿蔔基因轉化中位於葉綠體轉化載體的5’端上游。另外，這個有轉錄活性的空白區域是轉基因整合的首選位置，在這個位置進行的轉基因大大多於其他位置。

質體基因轉化改善了重要農作物的性狀，也有利於生產生物材料和治療性蛋白質，如抗體、生物藥物和疫苗抗原，等等。通過轉基因葉綠體的高水平基因表達，可以生產大量低成本的治療性蛋白質。像層析法這樣的純化方法在這兒根本不需要，口服治療性蛋白質根本不需要進行純化。正因為如此，幾家主要的生物技術公司已經啓動研究項目，目的是把這項技術商業化。

最近的研究認為，利用體細胞胚胎或胚胎發生愈傷組織產生質體基因轉化系統的意義十分重大，很有可能會開創幾種主要農作物質體基因組工程，它們需要通過體細胞胚胎發生實現植株再生。在很多作物上都已經實現了用體細胞胚胎發生的方式實現植株再生，包括穀類、豆類、油類作物、商品作物、蔬菜作物、水果/樹和堅果、飲料、木材，等等。

另外，質體基因轉化已經成為研究質體發生和功能的一個有力工具。這個工具被用來研究質體DNA複製起始點、RNA編輯元件、啓動子、RNA穩定因子、多順反子加工、內含子成熟、翻譯元件和蛋白質水解、一些重要蛋白質和其他幾個過程。因此，最近的進展對這些方面來説都是很好的開端，包括用轉基因質體生產治療性蛋白質、疫苗和生物分子，用無污染方法改良農作物，對質體的生物化學和分子生物學有更深入的瞭解。