菌種分離

培養基與菌種分離是指從含有多種微生物的樣品中獲得純種微生物的操作技術。菌種分離主要在培養皿上進行，常用的方法是稀釋法和劃線法。使用這兩種方法的目的是是微生物的一個個體通過繁殖，在固體培養基上長出肉眼能見的羣體，然後根據培養特徵，用接種針調取所需菌種並在顯微鏡下檢查，證明為單一形狀的菌體。常用的培養基是選擇培養基。如分離分解纖維素的微生物用的培養基是以纖維素為碳源的培養基，因為從這種培養基上長出來的只能是分解纖維素的微生物。改變培養基條件也有助於菌種分離。如為了得到嗜熱微生物，可以在50℃~60℃下對微生物進行培養。有時投加相應的抑制劑也能提高菌種分離效果，如在土壤樣品的懸浮液中投加10%的苯酚數滴，可以抑制黴菌和細菌的生長，而有利於放線菌的分離。在培養基中投加一定量的青黴素或鏈黴素能抑制細菌的生長，而有利於黴菌的分離。

實驗室常用微生物菌種的分離和純化方法。

單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長羣體，稱為菌落。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔。不同微生物在特定培養基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特徵，可以成為對該微生物進行分類、鑑定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養基上形成孤立的菌落，採用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板的簡稱，它是指固體培養基倒入無菌平皿，冷卻凝固後，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養基表面或裏面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質固化的培養基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便於移植。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的採用平板分離微生物純培養的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。

首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固後，製成可能含菌的瓊脂平板，保温培養一定時間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨後挑取該單個菌落，或重複以上操作數次，便可得到純培養。

因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且採用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是塗布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿，製成無菌平板，冷卻凝固後，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃塗棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經培養後挑取單個菌落。

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續劃線（圖2），微生物細胞數量將隨着劃線次數的增加而減少，並逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養後，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落並非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反覆分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

用固體培養基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露於空氣中不立即死亡，可以採用通常的方法制備平板，然後置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可採用化學、物理或生物的方法清除。對於那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可採用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化後冷卻並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開。培養後，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一隻滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一隻毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數種類在固體培養基上長得很好。然而迄今為止並不是所有的微生物都能在固體培養基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來獲得純培養。

稀釋法是液體培養基分離純化常用的方法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經稀釋後的大多數試管中沒有微生物生長，那麼有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀釋後的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的機率就會急劇下降。因此，採用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。

只能分離出混雜微生物羣體中佔數量優勢的種類是稀釋法的一個重要缺點。在自然界，很多微生物在混雜羣體中都是少數。這時，可以採取顯微分離法從混雜羣體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。

較大的微生物，可採用毛細管提取單個個體，並在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對於個體相對較小的微生物，需採用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鈎、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒有顯微操作儀時，也可採用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋後的樣品製備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限於高度專業化的科學研究中採用。

沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計特定環境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物羣體中把這種微生物選擇培養出來，儘管在混雜的微生物羣體中這種微生物可能只佔少數。這種通過選擇培養進行微生物純培養分離的技術稱為選擇培養分離，特別適用於從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數場合微生物羣落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時，單採用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，採用選擇培養分離的方法。或抑制使大多數微生物不能生長，或造成有利於該菌生長的環境，經過一定時間培養後使該菌在羣落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。

根據待分離微生物的特點選擇不同的培養條件，有多種方法可以採用。例如要分離高温菌，可在高温條件下進行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或裏面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開。可將微生物羣落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反覆進行，得到純培養物。

富集培養法原理和方法非常簡單，利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環境條件，使僅適應於該條件的微生物旺盛生長，從而使其在羣落中的數量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方面進行選擇，如温度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養等等許多方面。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞羣體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。

分離的目的通常是要得到純培養。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。含有二種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關係的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關係。對於這些生物，二元培養物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近於純培養的培養方法。另外，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。

在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用於實驗室微生物的分離與純化。微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋塗布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物羣體中經分離生長在平板上的單個菌落並不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特徵外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特徵後才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特徵鑑定才能得到。 ^[1] 

自然界中不同種類的微生物往往混雜在一起因此人類在尚未掌握菌種分離技術前，在釀造、制醬、做醋等發酵工業中所用的菌種都是混合菌種。1882年丹麥的漢遜分離出純種酵母菌，從此在釀酒業上用上了純種菌，使酒的產量和質量有了可靠的保障。19世紀末，應用菌種分離技術，許多嚴重威脅人類生命的傳染病病原菌被一一分離出來，為人類最終戰勝傳染病做出了重大貢獻。當前，菌種分離仍是開發微生物資源的重要手段。