致突變試驗

1、鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗

又稱Ames試驗，檢測受試物誘發鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型突變株(his-)回覆突變成野生型(his+)的能力。試驗菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養平皿上不能生長，回覆突變成野生型後能自行合成組氨酸，可在最低營養平皿上生長成可見菌落。計數最低營養平皿上的回變菌落數來判定受試物是否有致突變性。標準試驗菌株有四種：TA97和TA98檢測移碼突變、TA100檢測鹼基置換突變、TA102對醛、過氧化物及DNA交聯劑較敏感。這四個試驗菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。

試驗方法有點試驗(預試驗)和摻入試驗(標準試驗)兩種。在摻入試驗中，受試物最高劑量為5mg/皿或出現毒性及沉降的劑量，至少有五個劑量點，並有陰性(溶劑)對照和陽性對照。將受試物、試驗菌株培養物和S9混合液加到頂層培養基中，混勻後鋪在最低營養平皿上，37℃培養48小時，計數可見菌落數。判斷陽性結果的標準是，如每皿回變菌落數為陰性對照的每皿回變菌落數的兩倍以上，並有劑量－反應關係，即認為此受試物為鼠傷寒沙門氏菌的致突變物。

S9混合液是用多氯聯苯誘導的大鼠肝勻漿9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等輔助因子，作為代謝活化系統。如不加S9混合液得到陽性結果，説明受試物是直接致突變物；加S9混合液才得到陽性結果，説明該受試物是間接致突變物。只要在一種試驗菌株得到陽性結果，即認為受試物是致突變物；僅當四種試驗菌株均得到陰性結果，才認為受試物是非致突變物。

2、哺乳動物細胞基因突變試驗 野生型與突變型果蠅的體色

哺乳動物體外培養細胞的基因正向突變試驗常用的測試系統有小鼠淋巴瘤L5178Y細胞，中國倉鼠肺V79細胞和卵巢CHO細胞的三個基因位點的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+/K+ATP酶(OUA)位點。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點突變可用於上述三種細胞，OUA位點突變僅適用於CHO細胞，HGRPT和TK可分別使6－硫代鳥嘌呤(6－TG)轉移上磷酸核糖及使5－溴脱氧尿苷磷酰化，它們的代謝產物可摻入DNA引起細胞死亡，因此正常細胞在含有這些鹼基類似物的培養基中不能生長，在致突變物作用下此兩個位點發生突變的細胞對這些鹼基類似物具有抗藥性，可以增殖成為克隆(細胞集落)。Na+/K+ATP酶是細胞膜上的Na+/K泵，鳥本苷可抑制此酶活性引起細胞死亡，當致突變物引起該位點突變後，Na+/K+ATP酶對鳥本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對培養基中的鳥本苷產生抗藥性，並可增殖為克隆。

1、染色體分析

觀察染色體形態結構和數目改變稱為染色體分析。在國外常稱為細胞遺傳學檢驗，但這一名稱有時廣義地包括微核試驗和SCE試驗，因為這兩個試驗同樣也是在顯微鏡下觀察細胞染色體的改變。

對於結構畸變，一般只觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環、粉碎、雙或多着絲粒染色體和射體。對於缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析。即染色體攝影拍片後，再排列進行細微觀察或用電子計算機進行圖象分析。對於相互易位，除生殖細胞非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重複等均需顯帶染色才能發現。

對於數目畸變，需在染毒後經過一次有絲分裂才能發現。但是經過一次有絲分裂後，一些結構畸變可能因遺傳物質的丟失而致細胞死亡，因此不能發現。所以應安排多次收穫時間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收穫時間的安排還應考慮外來化合物可能在細胞週期的不同時期產生作用，以及延長細胞週期的作用。

體細胞的染色體分析可作體內或體外試驗，體內試驗多觀察骨髓細胞，體外試驗常用中國倉鼠肺細胞(CHL)，以及中國倉鼠卵細胞(CHO)和V79等細胞系，但任何細胞系的染色體皆不穩定，不能準確地觀察非整倍體，故在體外試驗中，如考慮進行染色體數目觀察，應當使用原代或早代細胞，例如人外周淋巴細胞。體內試驗與人體實際接觸情況相似，但應注意受試物或其活性代謝產物有可能不易在骨髓中達到足夠的濃度。體外試驗由於受試物與細胞直接接觸，故往往比體內試驗靈敏。

2、微核試驗 微核試驗

經致突變物作用後，染色體無着絲點斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個染色體在細胞分裂的後期仍留在子細胞的胞質內，成為一個或幾個規則的次核，稱為微核。常用齧齒類動物骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗。PCE是紅細胞成熟的一個階段，此時紅細胞的主核已排出，微核容易辯認，PCE胞質含RNA染色與成熟紅細胞易於區別，故為骨髓微核試驗的首選細胞羣。常用小鼠，至少設兩個處理組，最高劑量為LD50/7的80%(LD50/7為在7天內使半數動物死亡的劑量)，另一組為LD50/7的40%，灌胃或腹腔注射，同時設陰性和陽性對照組，每組至少8只動物，雌雄各半。給毒方案有多種，如連續四天，每天一次。第五天處死，取骨髓，塗片，固定，染色。每鼠計數1,000個PCE的微核出現率。當經適當的統計學分析，處理組微核率顯著高於陰性對照組，並呈現劑量－反應關係時，可認為受試物對該試驗動物的骨髓細胞有致染色體損傷的作用。

1.姐妹染色單體交換(SCE)試驗

SCE是染色體同源座位上DNA複製產物的相互交換，SCE可能與DNA的斷裂和重接有關，提示DNA損傷。SCE試驗可分為體外試驗、體內試驗和體內、體外結合試驗。體外SCE試驗可採用貼壁生長的細胞，如CHO、V79、CHL等，也可用懸浮生長的細胞，如人外周血淋巴細胞。細胞在含5-溴脱氧尿苷(BrdU)的培養液中生長兩個週期。由於Brdu是嘧啶類似物，可於合成期中摻入DNA互補鏈，所以在下一個中期所見染色體姐妹染色單體之間各有一條互補鏈摻入了Brdu，於是Brdu對稱姐妹染色單體造成同等的干擾，其染色並無區別。但到了第二個週期中期相，每個染色體中只有一條染色單體保留了原來不帶Brdu的模板鏈，而另一條染色單體則是上一週期帶Brdu的互補鏈成為模板鏈。於是經兩個週期的Brdu摻入互補鏈可使兩姐妹染色單體所含Brdu量不相等，從而出現染色差別。如果Brdu僅在第1週期摻入，第2週期不摻入，則第2中期相似可見姐妹染色單體染色有差別。如果DNA單鏈發生了斷裂，而且在修復過程中發生重排，就在第2週期可見姐妹染色單體同位節段的相互交換。經差別染色後，可觀察到兩條明暗不同的染色單體。若兩條染色單體間發生等位交換，可根據每條染色單體內出現深淺不同的染色片段進行識別和計數。

2.程序外DNA合成試驗

基本方法是測定S期以外3H-胸苷摻入胞核的量，這一摻入量可反映DNA損傷後修復合成的量。由於此種合成發生在DNA正常複製合成主要時期以外，故稱為程序外DNA合成(unschedule DNA synthesis UDS)試驗或DNA修復合成試驗。一般使用人淋巴細胞或齧齒動物肝細胞等不處於正在增殖的細胞較為方便，否則就需要人為地將細胞阻斷於G1期，使增殖同步化。然後在藥物的抑制下使殘存的半保留DNA複製降低到最低限度，才能避免摻入水平很高的半保留複製對摻入水平很低的程序外DNA合成的觀察。試驗結果的評定

各種致突變試驗都有其特定的觀察終點，但實驗結束後都面臨一個共同的問題，即所取得的數據表示陽性結果或表示陰性結果。

在評定陽性或陰性之前，應首先檢查實驗的質量控制情況。致突變試驗的質量控制是通過：①盲法觀察和②陰性對照和陽性對照的設立。盲法觀察是觀察人員不瞭解所觀察的標本的染毒劑量或組別，可免除觀察人員對實驗數據產生主觀影響。陰性對照指不加受試物的空白對照，有時則是加入為了溶解受試物所用溶劑的溶劑對照。陽性對照是加入已知突變物的對照，對於體外試驗應包括需活化的和不需活化的兩種已知致突變物。空白對照應和溶劑對照的結果一致，如有顯著差異則可能表明有實驗誤差，如溶劑對照結果顯著高於空白對照則可能溶劑具有致突變性。陰性對照和陽性對照結果都應與文獻報告或本實驗室的歷史資料一致。如差異較大也説明可能有實驗誤差。發現這些質量控制指標存在任何疑問時，均應查清存在的問題，並加以解決後，重新進行實驗。

陽性結果應當具有劑量反應關係，即劑量越高，致突變效果越大，並在一組或多組的觀察值與陰性對照之間有顯著差異。如果低劑量組或低、中兩劑量組與對照組之間的差異有顯著性，而高劑量組差異無顯著性，則陽性結果不可信或無意義。此時應檢查影響實驗的因素，在排除影響因素後，應考慮是否為劑量反應關係曲線的特殊形式所致，即曲線上升至一定程度後下降。如懷疑及此，應當在零劑量與最高觀察值的劑量之間重新設計染毒劑量。

陰性結果的判定條件是：①最高劑量應包括受試物溶解度許可或灌胃量許可的最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內試驗和細菌試驗應為最大耐受量，使用哺乳動物細胞進行體外試驗，常選LD50或LD80為最大劑量。溶解度大，毒性低的化學物，在細菌試驗中往往以5mg/皿作為最高劑量。②各劑量的組間差距不應過大，以防漏檢僅在非常狹窄範圍內才有突變能力的某些外來化合物。

無論陽性還是陰性結果都要求有重現性，即重複試驗能得到相同結果。