生殖支原體

生殖支原體外觀呈燒瓶狀，末端有一棒狀結構。生殖支原體是所有支原體中基因組最小的一種。最適宜的生長温度為37℃。生長非常緩慢，在一般培養基、液體培養基及有氧情況中不生長，在不含醋酸鉈的SP-4培養基中生長。生殖支原體可通過自身的黏附結構黏附於上皮細胞、紅細胞的表面，並可在細胞表面滑動，逐步進入上皮細胞及紅細胞內致病。

生殖支原體感染與非淋菌性尿道炎有關。有人用PCR技術檢測非淋菌性尿道炎，衣原體陽性患者尿中生殖支原體陽性率為28%，而衣原體陰性患者尿中生殖器支原體陽性率僅為7%。 ^[1] 

自從1981年生殖支原體(mycoplasma genitalium，Mg)首次從非淋菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis，NGU)患者尿道分泌物中分離以來，有關Mg的研究日益增多：從基因蛋白組、生物學性狀、培養特性等基礎研究到致病性、耐藥性、治療等臨牀研究都取得了較大的成果。Mg是已知能自行復制的基因組最小的生物體，廣泛存在於人類及動物宿主體內。隨着檢測技術的不斷髮展，Mg引起臨牀相關疾病的問題已引起醫學界廣泛重視，它在泌尿生殖道及其他相關性疾病中的作用越來越被關注。 由於缺乏有效的治療方法和疫苗，Mg感染一直影響着人類健康，繼而引起一系列社會經濟問題。近來大量流行病學研究提示Mg感染率正逐步上升，需要對Mg感染有整體透徹的理解以利於制定新的防治策略。Mg的基因組序列已經完成，從而使在分子水平研究Mg致病性成為可能，有關Mg致病性、Mg與其他多種疾病之間關係的研究具有重要的臨牀意義。

Mg對培養基要求極高且生長緩慢，培養較難。尤其是臨牀標本中Mg的培養更不容易成功。 ^[2] 

1、 培養基培養

Mg對培養基要求極高且生長緩慢，培養較難，尤其是臨牀標本中Mg的培養更不容易成功。Tully1981年建立了對醫學支原體具有重要意義的SP-4培養基。適合於Mg生長的SP-4培養基，不含醋酸鉈，含Mg代謝所需的葡萄糖及其它營養成份，最適pH為7.4-7.5，可通過加入0.8%Noble瓊脂或0.5~0.6%瓊脂而固體化，用於克隆菌株，觀察菌落，Tully等利用這種培養基，從13份尿道分泌物標本中分離培養獲得2株Mg，培養期約為50天。1996年Jensen等還報道了另一種適合Mg生長的培養基，即改良Friis肉湯培養基，11份PCR檢測Mg-DNA陽性的尿道分泌物標本中，有6份在其中呈陽性生長。

國內學者對SP-4培養基進行了改良。趙季文等利用改良的SP-4培基從性病及性亂人羣中分離Mg獲得成功，初代生長時間在30天以上，平均為37.83天，最長為55天。

2、組織細胞培養法

組織細胞培養支原體，可為支原體提供良好的類似體內的生長環境。早在60年代，Chanock等報道了肺炎支原體（Mp）在組織細胞中的生長。90年代，Jensen等開始嘗試用細胞培養法來進行Mg的繁殖，並藉此在電鏡下觀察到Mg侵入細胞的過程以及在細胞內的定位。在PCR的監測下，Jensec發現在11分PCR檢測MgDNA陽性的尿道標本中，有9份適應在Vero細胞磁頭中增殖，經過多次傳代培養後轉入改良的Friis fF肉湯培養基中，有6份能繼續傳代生長，最終在瓊脂培養基中克隆獲得4株。Jensen認為，在分離獲得新的Mg菌株方面，細胞培養繁殖過程起到了三方面的作用，一是使臨牀標本中的Mg逐漸適應在人工培養基中生長，二是增加了接種於支原體肉湯培養基中的支原體數量，三是提供持續的接種源。

根據Mg的免疫學特性，人們建立了用檢測Mg抗體和檢測與鑑定Mg抗原的血清學方法。

Furr等於1984年詳細報道了檢測Mg抗體的MIF技術。Moller等對31例未檢測出Ct和Mh血清抗體的急性盆腔炎患者，用MIF檢測Mg抗體，發現其中大約40%在發病後一個月內抗體滴度有4倍或4倍以上的改變。Taylor-Robinson等報道應用間接MIF檢測NGU患者Mg抗體，認為間接MIF試驗是一種具有足夠敏感性、特異性和簡便易行的檢測方法。Jensen等曾用EIA檢測有尿道炎症與無尿道炎症狀的男性STD患者急性期血樣標本中Mg抗體，結果發現反應性較弱，且與Mp存在廣泛的交叉反應。

根據特異性抗體能阻止支原體的生長及代謝這一特性，可採用已知高價血涉及進行祖先生長及代謝抑制試驗以鑑別支原體。趙季文等曾採用MIT鑑定所分離獲得的Mg菌株。

暴露於支原體表面的脂結合膜蛋白（lipid-associated membrane proteins,LAMPs是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其LAMP抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法檢測Mg抗體，可消除Mg與Mp之間的交叉反應。

DNA探針和聚合酶鏈反應（PCR）檢測Mg的方法，克服了前兩類檢測方法的弊端，為研究Mg與疾病的病因學關係提供了有力的手段。

1、DNA探針技術

1987年Hyman用PUCB載體構建成Mg基因文庫，並從中篩選製備出特異性DNA探針，通過斑點雜交，可檢測僅含0.1ng的特異性支原體DNA，即105CFU。

2、 聚合酶鏈反應（PCR）技術

PCR是一種新的基因診斷技術，靈敏度高，特異性強，且快速、簡便。1990年，PCR技術開始在醫學支原領域應用。

早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的DNA序列而設計。Palmer等體外擴增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出現37bp的DNA片斷，並證明PCR技術可檢測到10-15g的mg-DNA，其引物序列的：

mg1:5'TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3'

mg2:5'CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3'

1991年Jensen等根據Mg的粘附蛋白基因設計合成瞭如下組引物：

mgPa-1 5'AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3'

mgPa-1 5'GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3'

mgPa-1 5'CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3'

用MgPa-1 和MgPa-3成功地擴增出Mg的281bpDNA片段，5個臨牀分離株擴增出同樣的產生，而其他支原體和細菌均為陰性，用MgPa-2作探針，對擴增產物經Southern eP印跡雜交，均為陽性，證明引物具有特異性，共檢出下降大約有50個Mg細胞。1993年Jensen等又根據Mg粘膜蛋白基因設計了另一對引物，即：

mg粘附蛋白基因設計了另一對引物，即：

mgPa-476：5‘ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3’

mgPa-903：5‘TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA TGC3’

用來證實和補充引物MgPa-1和MgPa-3所擴增的結果，其擴增片段為453bp。研究發現，這兩對Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測99例尿道炎病人的尿道拭子，結果17例Mg陽性，而用培養法無一例陽性。

1994年Jensen擴增Mg粘附蛋白基因序列並測序表明：該序列在Mg條件之間有明顯異質性，為此，Jensen等學者根據原體屬性高度保守區域16SrRNA的基因序列，設計了種特異性PCR引物，以期檢測臨牀標本中所有Mg的感染：其引物序列為：

Mg-1，5‘GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCTG3’

Mg-2，5’ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT GGCT3‘

4種臨牀標本的實驗結果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列則是100%同源，將兩種引物PCR結合，還可在可疑陽性標本中檢測出10-50個Mg基因拷貝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因為靶基因的PCR系統在保證長期特異性基礎上更為靈敏。

趙季文等採用Palmer設計的引物，擴增mg37bpDNA片段，檢測三種人羣的Mg，結果是性亂人羣陽性率為25.26%，性病人羣為12.33%，而健康人羣為3.85%。孔繁榮等[20]採用Jensen設計的MgPa-1和MgPa-3，擴增Mg281bpDNA片段，檢測結果是性亂婦女Mg檢出率為10.2%，STD患者為4.0%。

1998年，糜祖煌等[2]研究報道了分別以Mg粘附蛋白和16rRNA基因為靶基因建立的二種套式PCR檢測技術，前者擴增生Mg的374bpDNA片段，後者擴增產生241bpDNA片段。套式PCR不僅提高了靈敏度，而且因採用兩對不同的引物，特性也進一步的得到提高。用這些法檢測40例女性STD患者，發現Mg陽性12例，陽性率30%，檢出陽性率均高於普通PCR法。

微生物感染診斷的“金標準”是培養法，然而Mg培養成功率極低，有待於對培養基進行進一步的研究和改良，以促進Mg在其中的生長；此外，將細胞株引入Mg的培養可能是一個較好的方法，有必要加強這方面的探索和研究。免疫學檢測方法因支原體種屬間易出現交叉反應以及對抗原、抗體純度要求較高而在實際應用上受到一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測臨牀標本中Mg抗原的方法，則具有較大的實用價值。PCR技術是一個簡單而又直接的檢測Mg方法，正被日益廣泛地採用，主要用於Mg感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人羣中Mg的流行病學研究。但在應用時應注意：①臨牀標本中Mg含量低，DNA純度不夠，抑制物過多，TaqDNA聚合酶活性低均會引起假陰性，應進一步完善模板DNA的提取技術；②因PCR靈敏度極高，在整個操作過程中均應嚴格避免PCR產物的污染，以減少假陽性。

一、Mg與非淋菌性尿道炎(NGU)

在性活躍的年輕人羣中泌尿生殖道異常與Mg衞之間有強相關性，有症狀患者中Mg陽性率高達12%。一項對335例有尿道炎症狀的男性患者進行相關致病原的檢測研究結果強烈支持Mg在男性尿道炎中的致病作用。許多病例對照研究顯示急性NGU患者的Mg感染率明顯高於對照組，提示Mg是急性NGU的高危因素，並且發現感染Mg的患者比感染沙眼農原體(Ct)的患者更容易出現尿道炎症狀，提示Mg可能是尿道中獨立於ct的致病因子，去除ct因素後，Mg與NGU的相關性有所提高，進一步説明了Mg在NGU中有獨立的致病性。臨牀上許多有症狀的複發性NGU患者經抗生素治療後Mg仍陽性，提示Mg持續存在於尿道可能是導致NGU復發的原因。

二、Mg與前列腺炎

半數男性在一生中至少出現過1次前列腺炎症狀，但90%的患者找不到明確病因，推測前列腺可能藏匿了不易被傳統技術檢測到的微生物。PCR檢測慢性頑固性前列腺炎患者中的病原體，結果顯示Mg感染與慢性前列腺炎可能有一定聯繫。另外Mg在慢性前列腺患者精液中檢測率亦高於正常健康人羣。但Mg在前列腺炎中的致病作用目前還不確定。

三、Mg與女性生殖道感染

1、Mg與細菌性陰道病

有研究者對細菌性陰道病患者進行Mg檢測，但未發現Mg與細菌性陰道病之間有明顯聯繫。

2、Mg與黏液膿性宮頸炎(mucopurulent cervicitis，MPC)

對非洲西部826位女性性工作者進行大樣本臨牀研究發現其中26．3%感染有Mg，並發現Mg與宮頸炎相關。Mg感染作為引起宮頸炎症的獨立致病因子，是MPC的高危因素，故有必要將Mg考慮為MPC(尤其是未發現NG和Ct感染的MPC)潛在的重要病原體。

3、Mg與子宮內膜炎

58例組織學已經證實為子宮內膜炎的患者中有9例檢測Mg陽性，顯示Mg感染與子宮內膜炎存在一定關聯。 ^[3]