熒光定量PCR技術

理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線並不是標準的指數曲線，而是S形曲線。

這是因為隨着PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以後，PCR就進入了平台期。由於各種環境因素的複雜相互作用，不同的PCR反應體系進入平台期的時機和平台期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次PCR重複實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異，所以在實驗過程中我們不能根據最終PCR產物的量直接計算出起始DNA拷貝數。 ^[1] 

接下來我們就來了解一下熒光定量的主要方法，我們如何選擇合適的方法？熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射出熒光信號。前者由於增加了探針的識別步驟，特異性更高，但後者則簡便易行。

非特異性SYBR Green I染料法

SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料（結合示意圖），在遊離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合後，熒光大大增強（作用機理圖）。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

特異性Taqman水解探針法

Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；

PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。從而實現定量。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。