數字PCR

在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結了，因為數字PCR（digital PCR）來了。儘管這兩種技術有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數字PCR則讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用於依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對錶達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。 ^[1-2] 

20 世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束後對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。 ^{[1]  [3]} 

數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法，光度法基於核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（Real Time PCR）基於Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數；數字PCR是最新的定量技術，基於單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要採用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋後的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少於或者等於1個。這樣經過PCR循環之後，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脱氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應，擴增的特異性取決於引物與模板DNA的特異結合。

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