抑制性消減雜交技術

通過合成兩個不同的接頭，連接於測試cDNA 片段的5’末端，達到選擇性擴增差異性表達的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的擴增。該技術是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基礎上建立起來的cDNA消減雜交方法，它克服了DD法的假陽性較高和RDA法消減雜交輪次較多的缺點，十分適用於克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及其功能。

抑制性消減雜交技術是一種以抑制性PCR 反應為基礎，將標準化測試cDNA 單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。通過合成兩個不同的接頭，接於經限制性內切酶消化後的測試cDNA 片段的5’末端，將測試和驅動進行兩輪雜交。所謂抑制性PCR 是利用鏈內退火優於鏈間退火，使非目的序列片段兩端的長反向重複序列在退火時產生“鍋柄樣”結構，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列片段擴增。

抑制性消減雜交技術的基本實驗過程如下。首先，將要進行比較的兩種組織或細胞來源的mRNA 樣品反轉錄為cDNA，把含有目的基因的cDNA 稱為測試(tester)，把參考cDNA 稱為驅動(driver)，用同一種限制性內切酶Rsa I 切割，產生末端平頭的片段，將測試cDNA 分為兩份，每份連接不同的接頭，即接頭1(adaptor 1)和接頭2(adaptor 2)。接頭為雙鏈DNA 片段，且5’- 端均無磷酸基，這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA 的5’- 末端連接，兩個接頭含有可識別的序列. 接下來進行兩次雜交。第一次雜交每個測試里加入過量驅動，然後變性、退火，根據雜交動力學第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此測試cDNA與驅動cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子，使得差異表達的單鏈分子得到富集。第二次雜交，將進行過首次雜交的兩組樣品不經變性而直接混合，只有剩下的經過消減並平均化了的差異表達的單鏈cDNA 可以重新結合為新的雜交體分子，這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2，加入新鮮變性的驅動進行第二輪消減雜交，進一步富集差異表達的雜交體分子，並用DNA 酶補平末端，這樣差異表達的測試序列- 雜交體分子5'- 和3'- 端就有了進行巢式PCR 所需的不同的退火位點。最後，進行兩次PCR 反應，第一次PCR 只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA 片段才得以指數擴增，而其他形式如一端有接頭，而另一端無接頭的只能線性擴增，沒有引物結合點的不能擴增，還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無法獲得指數擴增。利用巢式引物進行第二次PCR，富集差異表達的基因片段. PCR 產物可以被直接插入T 載體，或者利用接頭1 上的NotI/SmaI/XmaI 位點和接頭2R 上的EagI 位點進行定向克隆，或者接頭與cDNA 連接處的RsaI 位點平端克隆。然後利用測序和雜交分析來分析差異表達的序列，或者用PCR 產物作探針來篩選DNA 文庫。 ^[1]