徒手切片法

徒手切片前，應先準備好一個盛有清水的培養皿。在切片時，用左手的拇指與食指、中指夾住實驗材料，大拇指應低於食指2～3mm，以免被刀片割破。材料要伸出食指外約2～3mm，左手拿材料要鬆緊適度，右手平穩地拿住刀片並與材料成垂直。然後，在材料的切面上均勻地滴上清水，以保持材料濕潤。將刀口向內對着材料，並使刀片與材料切口基本上保持平行，再用右手的臂力（不要用手的腕力）向自身方向拉切。此時，左手的食指一側應抵住刀片的下面，使刀片始終平整。連續地切下數片後，將刀片放在培養皿的水中稍一晃動，切片即漂浮於水中。當切到一定數量後，可在培養皿內挑選透明的薄片用低倍鏡觀察檢查。好的切片應該是薄且比較透明、組織結構完整，否則要重新進行切片。

對經檢查符合要求的切片，如果只作臨時觀察，可封藏在水中進行觀察。若要更清楚地顯示其組織和細胞結構，可選擇一些切片進一步通過固定、染色、脱水、透明及封藏等步驟，做成永久玻片標本。

徒手切片技巧

如果不想切斜，要注意兩點，一個是左手拿的露出來那截要短，儘量只能連續切2刀的樣子(一般是可以切4，5刀的），一個是切口一定要水平，同時右手的刀片也要水平，拉刀的時候保持在一個平面上（拉快點容易做到）。這是根和莖的切法，不過每次的量會有所減少。對於葉，有三種切法，一個是直接切；一個是捲成管狀，當莖來切；還有就是用三層刀片夾起來。其中，第一種適合於裸子植物那種針葉，方法要領和上面説的差不多；第二種適合於比較軟的葉片，要領是要卷的細，中間的洞不要太大（大了容易斜）；第三種適用於比較堅韌，硬的葉片，絕對要放在載玻片之類的地方，要用劃的，凌空切會很不順，容易切不斷。還有一種特殊的方法是切成小塊的先，再夾到蘿蔔裏面（事先挖個洞或切條槽），再一起切，這個適用於全部，根莖葉，軟的硬的均可（就是那種針葉不太好用它，我都切不好）。所以克服柔軟就是要注意，想辦法使它變厚變硬（對葉：卷，夾，或者墊玻璃；對根莖，夾，或者用左手捏緊一點，捏上面一點，使它不會晃）。至於彎曲，我覺得不用太在意，要麼捨棄掉這一段，要麼用手壓緊，關鍵只是上面要平。還有，如果切含有楞或者有葉脈的部分，一定要從這些地方開始切，先切硬的部分（朝向刀口）。平時切兩到三層差不多，一層的細胞會破損，有空洞；這樣也比較適合染色。

徒手切片的優缺點

徒手切片是用手持雙面刀片或剃刀，將新鮮材料或預先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不經染色或經簡單染色後，用水封片作臨時裝片觀察。徒手切片法的優點是不需要複雜的設備，方法簡便，製片迅速，而且能觀察到植物組織的自然色澤和活體結構，常用於研究植物解剖結構、細胞組織化學成分，植物資源鑑定等。同時，它具有利於臨時觀察、能夠較快的得到結果的優點。缺點是對於體積過小、太軟、太硬的材料則難於切片，而且不能製成連續切片。 ^[1] 

研究背景

木材作為一種生物質材料，存在較大的變異性，同一樹種間甚至同株不同部位的木材特性都會表現出較大的差異。但木材微觀構造特徵中，這種差異則相對較小。通過對木材微觀結構觀察識別鑑定，其準確度與可信度都非常高。隨着進口材增多，由木材名稱混亂而帶來的糾紛也越來越多。木材識別不僅是解決該類糾紛的有效途徑，而且可為確定樹種名稱、辨別樹種真偽、幫助尋找代用材料、為乾燥及塗飾等加工工藝的制訂提供參考依據。但由於大多數進口材材質較為堅硬，內含物較豐富，有些甚至富含晶體或硅石，採用常規的切片方法，不僅需要較長的軟化時間，其軟化尺度也很難把握，軟化不好則很難得到滿意的切。此外，由於處理糾紛需有一定的時效性，快速準確的得出鑑定結論顯得尤為重要。徒手切片法在木質化程度較高的木材中的應用只是在文獻中簡單提到，而具體的操作方法尚未見報道。筆者在實踐中嘗試採用徒手切片法進行樹種鑑定，不僅可保證結論的準確可靠，而且也滿足了快速高效及低成本的要求。

工具的選擇與製作

切片工具的好壞直接關係到木材切片質量的高低，因此，要求切片刀平整、鋒利，並具有較大硬度，通常利用高速鋼機用鋸條的邊角料，其形狀以方便手握切削為宜。刃口尺寸一般小於 20 mm，其目的是減小切削阻力。切片刀通常採用比較傳統的手工磨刀方法，一般可製成單面刃磨刀片，研磨角θ=15～ 30°，研磨角小，刀刃較為鋒利，但耐久性較差，容易產生豁口，研磨角大則剛性大，適宜於切削硬重的木材，如鐵樟(Eusideroxylon zwageri)、重坡壘(Hopeaspp.)等。

切片與裝片

與常規切片相比，徒手切片很難切出很規整的切片，故不便作為木材解剖性質如徑向變異性的研究依據，但適宜進行木材微觀特徵的觀察與記載。因此，切片時無須要求切片的完整性及尺寸的大小，而應在同一個切面上多次切削，力求得到厚度較薄的切片。切片時，切削角儘可能小，以能從試塊上切出薄片為宜(圖1)。由於切片較小，為便於裝片，3 個切面上的切片應分別放置在盛有水的培養皿中，盛水的目的是使切片能自由展開，便於後期裝片。因橫切面上主要觀察管孔式、管孔的組合方式、管孔的內含物、軸向薄壁組織類型等特徵，對切片厚度的要求相對要低，容宜切制；弦切面主要由於木射線是木材中的橫向排列的組織，切片時的切削阻力主要受厚壁細胞的影響，因而受力較為均勻；徑切面上則由於薄壁組織與厚壁組織交替出現，切削阻力不斷變化，從而影響切片質量，但徑切面切片提供的射線組織類型等信息，是進口闊葉樹木材識別的非常重要的依據，因而對徒手切片提出了更高的要求。

徒手切片法得到的切片尺寸較小，為全面反映木材的微觀構造特徵，裝片時應在同一載玻片上儘可能多的裝載切片。為便於觀察，客觀的記載木材的微觀特徵，儘可能挑選厚度較薄、面積較大的樣品，每一載玻片上只裝來自於同一切面的切片，每一切面一般裝2～3個臨時切片，縱切面切片裝片前需用質量分數為50%、70%、85%、95%及100%的酒精進行逐級脱水，橫切面切片則可直接裝片，但應排除殘留在蓋玻片內的氣泡。兩者均依靠毛細管力使切片固定，應即裝即觀察，以免切片因乾燥應力捲曲使蓋玻片拱起而前功盡棄。

觀察時應本着逐面進行、化零為整、多切片多視野觀察、同切面不同切片相互補充和佐證的原則，並對所觀察的特徵進行詳細記載，然後查閲相關資料進行檢索。對於疑似木種的某些在切片上未表現或表現不明顯的特徵，可以有針對性的重新切片和觀察，如此循環，直致得出最後結論，將鑑定的原始紀錄及試樣編號並妥善保存，以備質疑複檢。 ^[2] 

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是僅次於玉米和小麥的世界第三大糧食作物，是單子葉植物、 特別是禾本科作物進行生物學研究的模式植物，其主要原因是水稻的基因組較小和重複序列少。水稻的全基因組序列已知，並已經構建成高密度的物理圖譜和遺傳圖譜，有助於對水稻基因功能的研究。穀子是在我國種植歷史最為悠久的雜糧作物之一，與玉米、 高粱等其他禾本科作物相比，穀子基因組更小，且隨着高通量測序技術的發展，在 2012 年對穀子完成了全基因組測序，基因組大小為 423 Mb，其中 81%的基因已經被註釋。又因穀子為C₄植物，且與水稻的基因組有高度共線性，對穀子的功能基因研究勢必會成為未來研究的熱點問題之一。從生物學或是遺傳學意義而言，突變體是生物體某個性狀或某個基因(或染色體)發生 DNA 的鹼基變化的個體。

對於突變體庫的構建技術已經成熟，但是用任何一種誘變方法產生的突變體數量都很多，對於目的突變體植株的篩選工作量很大，尤其是對於篩選植物解剖學方面的突變植株。 對於解剖學方面突變體篩選的研究主要集中在泡狀細胞發生改變的突變體、維管束數目間距及維管束間葉肉細胞數目發生變化等的突變體的篩選。主要的方法是進行石蠟切片觀察，但是石蠟切片流程長，耗時久，且揮發性有機試劑利用量大，對人體有危害。本研究改進了徒手切片的方法，增加了透明過程，對染液進行了篩選。該方法可對突變體材料進行預篩選，對於突變體的解剖學篩選過程，從取材到觀察僅需一個小時，大大縮短了時間，且有機試劑使用量大幅減少，既能減少對人體危害，又能降低實驗成本。

徒手切片操作簡單，與石蠟切片方法相比不需要進行固定、脱水、浸蠟、包埋等過程，從而大大縮短實驗操作流程，減少耗時，且僅在透明和染色過程中需用試劑處理材料，從而降低實驗成本。另外，徒手切片還不需要切片機等貴重儀器，作為對於解剖學突變體的預篩選過程，可以很大程度上減少工作量，提高篩選速率，降低研究成本。還可以作為對需要做石蠟切片觀察的實驗材料進行初選，及對不需要進行精細觀察組織結構的實驗研究提供簡便方法。傳統徒手切片方法為單手利用一片刀片切片，由於水稻和穀子葉片較窄，質地較軟，單手切片不易切出理想材料。本方法利用雙手用兩片雙面刀片進行切片，材料切片切口整齊，厚薄均一，且避免了切片時由於來回拉切對材料造成的損傷。穀子和水稻兩種植物葉片葉綠素含量很高，且相比較於石蠟切片、半薄切片等厚度均厚許多，不進行透明操作直接進行觀察，或是用酒精脱去葉綠素後觀察均不能看清細胞邊界，本方法利用水合氯醛的飽和乳酸溶液進行透明後得到完整、清晰的觀察結果。水合氯醛是常用的化學透明劑之一，它能夠迅速進入組織，還可以溶解植物葉綠體、樹脂、蛋白質、及細胞內很多種內含物，使植物細胞清晰透明，易於觀察。

經過透明後的植物組織需用染色劑進行染色，染色後可以使各部位顯示出不同顏色，以便於更加清楚的觀察各組織的結構。不同染液可以使組織不同部位顯示出顏色差異。蘇木精為一種核染料，還可以使植物組織中的纖維素、 質體等着色。甲苯胺藍是一種鹼性染料，與不同的組織作用會產生不同的顏色反應：如可以將初生細胞壁染成紅色，木質素可以染成淺綠色，細胞質可以染成紫紅色等，是植物組織染色中應用比較普遍的一種染料。本方法經試驗發現甲苯胺藍相比較於蘇木精染液染色效果更好，觀察更為清晰。

徒手切片技術因其操作簡單、 製作快速等優點，在很早之前便運用於植物學形態觀察和教學中，它能夠觀察新鮮材料組織和細胞的自然色澤，看到活體細胞結構狀態，是石蠟製片之前初選實驗材料常用的簡易製片方法。本實驗優化了傳統徒手切片的製作過程，對徒手切片的流程增加了透明過程，另外對染液的選擇進行了篩選，發現甲苯胺藍的染色效果較為理想。另外水稻的成熟葉片也運用本方法進行了觀察，同樣可觀察到清晰結構，説明本方法不僅可以應用於幼嫩材料。對徒手切片的這些改進給科研工作者製備禾本科作物的組織切片提供了簡易方

法。而且本方法既經濟適用、又簡單易行，也可運用於生物學實驗教學中。 ^[3]