尿苷二磷酸葡萄糖

閃點：26ºC

儲存條件：-20ºC ^[1] 

危險品運輸編碼：UN 2910 7

危險類別碼：R10

安全説明：S16 ^[1] 

方法：提取基因組DNA作為模板，通過PCR擴增得到酶基因，經DNA體外重組構建表達質粒。結果：實現在大腸桿菌中的表達，併成功轉化黃原膠菌株。轉化過程提示黃原膠菌株可能具有某些特殊性。

建立了一種經濟、簡便的一步酶法，大量合成尿苷二磷酸葡萄糖。在酶法合成中，用UTP代替ATP，並建立了UTP的再生系統；建立了反覆補加法和酶回收法，使酶的利用率達到最高。 ^[1] 

黃原膠是由野油菜黃單胞菌（Xanthomonascampestris）分泌的胞外雜多糖，是目前產量最高的微生物多糖之一，具有假塑性、温度和pH穩定性，以及與鹽類良好的相容性，廣泛應用於食品、石油、化工、醫藥等領域。國外關於黃原膠的研究從20世紀60年代起步，國內自70年代開始，包括菌種選育、發酵工藝研究、黃原膠理化性質探討及其免疫學活性分析等。經查閲資料發現，在黃原膠的合成過程中，含糖的底物需要尿苷二磷酸葡萄糖脱氫酶（uridinediphosphateglucosedehydrogenase，UDPGD）的催化才能生成葡萄糖醛酸，而後者是黃原膠生物合成的前體之一。故此，我們設想以黃原膠菌株基因組DNA為模板，通過合成引物、擴增、克隆得到UDPGD基因，在實現大腸桿菌的表達後，再轉入原黃原膠菌株，希望UDPGD酶量的增加能夠帶來黃原膠產量增加的正效應。文獻報道UDPGD基因全長1338bp，285bp處含PstⅠ切點，740bp處含BamHⅠ切點，編碼445個氨基酸，蛋白相對分子質量48432。經過實驗，我們對UDPGD的研究工作取得了初步結果。 ^[1] 

1、一鍋法合成UDPG

早期研究的酶法合成UDPG通常都是通過Leloir途徑，從六位碳被標記的14C-葡萄糖出發，經巳糖激酶葡萄糖磷酸變位酶、UDPG焦磷酸化酶三步酶法催化，過程中需要添加腺苷三磷酸（ATP）和尿苷三磷酸（UTP）等輔底物，產率達到80%～95% 。葡萄糖-1-磷酸的生成是所有反應的限速步驟，反應平衡不利於葡萄糖-1-磷酸的生成，而添加焦磷酸酶能夠迅速轉移過程產生的焦磷酸，使得整個過程有效正向進行。Ma等從¹³C標記葡萄糖出發，利用傳統Leloir途徑偶聯尿苷三磷酸再生系統合成UDPG，實現了UDPG的0.5g級高產，產率達到70% 。在整個過程中，添加由丙酮酸激酶參與的尿苷三磷酸再生系統來保持尿苷三磷酸濃度。之前有報道稱，當UTP/Mg²⁺摩爾比達到1：1或1：2時，Leloir法制備UDPG產率非常低，但Ma等發現，UTP/Mg²⁺摩爾比1：2時，UDPG的產率仍達到85%以上，證實了高濃度Mg²⁺並不是Leloir法產UDPG的重要抑制因素，而 當UTP濃度高於2mmol/L時，UDPG產率顯著降低，因此UTP的濃度是影響UDPG產率的重要因素。

Bae等在大腸桿菌MV1184（Escherichia coliMV1184） 中重組表達棲熱菌GK24UDP糖焦磷酸化酶（Up） ，將重組酶純化後用於轉化UDPG。實 驗結果表明UDPG轉化率達到31.6%，產物純化後UDPG產率達到9.7%，當以N-乙酰葡糖胺（Glc NAc） 為底物生產UDPGlc NAc時，產物純化後產率達到41.1% 。Muthana等以普通葡萄糖-6-磷酸為底物，通過重組表達長雙歧桿菌ATCC55813（Bifidobacterium longum ATCC55813）UDPG焦磷酸化酶（BLUSP） 和多殺巴斯德菌無機焦磷酸酶雙酶偶合小規模產UDPG，UDPG產率高達99%，避免了使用昂貴的¹³C或¹⁴C葡萄糖。因此採用基因重組表達外源酶系的方法使酶來源不再受限制，給UDPG酶法合成提供了新思路。

2、兩步酶法合成UDPG

Zervosen等報道了一種兩步酶法合成UDPG。尿苷單磷酸（UMP） 經尿苷單磷酸激酶生成尿苷二磷酸（UDP） ，這一步伴隨着ATP的去磷酸化並偶聯丙酮酸激酶催化的ATP再生過程，UDP在蔗糖合酶的催化下與蔗糖發生反應生產UDPG和果糖，UDPG產率為38% 。在反應過程中，蔗糖合酶利用蔗糖糖基基團的能量直接催化蔗糖的裂解，避免使用昂貴的活化葡萄糖，Su Sy從稻米中提取獲得，每千克稻米約產63U的蔗糖合酶。Rmer等在釀酒酵母22574d中表達土豆（Solanum tuberosum L．） 蔗糖合酶（Su Sy1） ，30L發酵罐中連續發酵36h，粗酶液中Su Sy1比酶活達0.3U/mg，與稻米產Su Sy相比，產率提高7倍左右。

3、糖基轉移酶可逆催化合成UDPG

Ryu等發現一種新型的糖基轉移酶可逆催化海藻糖製備UDPG法。來源於Pyrococcus horikoshii的海藻糖糖基轉移酶（Tre T） 能夠催化核苷二磷酸葡萄糖和單糖產海藻糖，普遍的觀點認為這類基於核苷磷酸糖的糖基轉移酶催化的反應是不可逆的。但已有報道稱另一種來源於Thermococcus litoralis的海藻糖糖基轉移酶能夠催化可逆的反應。Ryu等也發現來源於Pyrococcus horikoshii的海藻糖糖基轉移酶能夠可逆地催化海藻糖和尿苷二磷酸產UDPG，並設計了一個固定化酶分批催化產UDPG的過程。

以超濾膜固定化糖基轉移酶，重複19批次循環反應，平均每批產率達10%，證實了固定化海藻糖糖基轉移酶能夠用來批量催化產UDPG。

UDPG迄今為止，儘管有許多關於化學法和酶法制備UDPG的研究報道，但通過綜合分析可以發現，利用細胞內的酶系來合成UDPG能夠避免使用純酶，受細胞壁保護的胞內酶穩定性更好，還容易實現酶的級聯反應。因此，在基因工程菌中過表達UDPG合成酶系，通過控制代謝流量提高胞內UDPG的合成，胞內UDPG被直接利用作為底物偶合主反應，避免向反應體系中額外添加UDPG，降低了生產成本。胞內合成UDPG的途徑涉及多個代謝途徑和多條基因。利用葡萄糖從頭合成UDPG會影響糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、核苷酸合成和能量代謝。

1、過表達UDPG合成途徑中的關鍵酶

Mao等在大腸桿菌中過表達UDPG合成途徑上的兩個關鍵酶: 葡萄糖磷酸變位酶和UDPG焦磷酸化酶，使其從葡萄糖-6-磷酸節點處分向UDPG合成的碳流量比對照菌提高8倍多。但若超過一定誘導劑濃度範圍，UDPG的合成量不再隨酶的表達水平的提高而增加，説明尚存在其他因素是影響UDPG合成的瓶頸。Oh等在大腸桿菌中引入UDPG焦磷酸酶、UDP激酶、UDP-葡萄糖-4-變旋酶和β-1，4-半乳糖基轉移酶4個酶，使重組菌的乙酰氨基乳糖合成量提高了10倍，同時其乳糖合成量也提高了2.6倍。Jesús克隆了由nis A啓動子操控的乾酪乳球菌BL23基因gal U，通過同源過表達，UDPG焦磷酸化酶活性提高了100倍，UDPG合成量提高了9倍。

2、異源表達UDPG合成酶系

Bosco等克隆了野油菜黃單胞菌（Xanthomonas．campestris pv． campestris）和柑橘潰瘍病菌中編碼UDPG-焦磷酸化酶的基因gal U，分別在兩株大腸桿菌中過表達，重組菌合成UDPG的最大速率VMAX均能達到空白對照菌株的7倍左右，值得注意的是，在UDPG合成中，重組菌UDP-焦磷酸化酶比酶活達到60～90U/mg，遠高於大腸桿菌（4.8U/mg）、伊樂藻屬和肺炎鏈球菌屬。 ^[2]