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多克隆抗體技術
鎖定
多克隆抗體技術免疫動物
供免疫用的動物常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動物的選擇常根據抗體的用途和量來決定，也與抗原的性質有關。如要獲得大量的抗體，多采用大動物；如要是獲得直接標記診斷的抗體，則直接採用本動物；如要獲得間接的標記診斷用抗體，則必須用異源動物製備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以採用純系小鼠製備；一般實驗室採用的抗體，多用兔和羊製備。
免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，雌性動物特別是妊娠動物用於製備免疫抗體則非常不合適，有時甚至不產生抗體。由於對免疫應答的個別差異，免疫時應同時選用數只動物進行免疫。
抗原是多種多樣的，而且千差萬別。就其化學成分而言，有蛋白質抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質抗原，如要製備用於篩選細菌表達的cDNA文庫或免疫印跡的抗血清，最好選用可降解的蛋白質抗原。不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種免疫原性的強弱取決於抗原的分子量、化學活性基團、立體結構、物理形狀和彌散速度等。
抗原的免疫劑量是依照給予動物的種類、免疫週期以及所要求的抗體特性等不同而不同。劑量過低，不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的範圍內，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而言，小鼠的首次免疫劑量為50μg～400μg/次，大鼠為 100μg～1 000μg/次，兔為200μg～1 000μg/次。加強計量為首次劑量的1/5～2/5。
免疫劑量與注射途徑有關，一般而言，靜脈注射劑量大於皮下注射，而皮下注射又比掌內和蹠內皮下注射劑量大，也可採用淋巴結內注射法。加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對家兔而言，採用弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg～1mg/kg./次，如採用弗氏不完全佐劑則注射劑量應大10倍以上。如要製備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法。如需要獲得高效價的抗血清，宜採用大劑量長程免疫法。免疫週期長者，可少量多次。免疫週期短者，應大量少次。
兩次注射的間隔時間應長短適宜,太短起不到再次反應的效果，太長則失去了前一次激發的敏感作用。一般間隔時間應為5~7天，加佐劑者應為2周左右。
注射的Ig純度高，則一般不易引起過敏反應，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時，極易引起過敏反應，所以一定要採取措施。
多克隆抗體技術佐劑的應用
對可溶性抗原而言，為了增強其免疫原性或改變免疫反應的類型、節約抗原等目的，常採用加佐劑的方法以刺激機體產生較強的免疫應答。
多克隆抗體技術佐劑的類型
實踐中常應用的佐劑有氫氧化鋁膠、明礬、弗氏佐劑、脂質體和石蠟油等。也有采用結合桿菌等分枝桿菌、白喉桿菌以及細小棒狀桿菌等。
⑴ 弗氏不完全佐劑（incomplete Freund’s adjuvant,IFA）
羊毛脂 1 份
石蠟油 5 份
混合，高壓滅菌後保存。用時加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進行乳化處理。
⑵ 弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant,CFA）
弗氏不完全佐劑 10ml
卡介苗 10mg～200mg
卡介苗可100℃10min滅活處理。
初次免疫時，最好用弗氏完全佐劑，以刺激機體產生較強的免疫反應。再次免疫時，一般不用完全佐劑，而採用弗氏不完全佐劑。但在研究分枝桿菌及相關抗原時，一般不用弗氏完全佐劑，以免卡介苗的干擾。
⑶ 脂質體：是人工製備的類脂質的小球體，由一個或多個酷似細胞膜的類脂雙分子層組成，這種結構使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性物質，他們被包裹在脂質體內部的水相中，或插入類脂雙分子層或吸附、聯接在脂質體的表面，起到明顯的免疫增強作用。
⑷ 油佐劑 ：採用植物油和礦物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。應用最廣的礦物油。
10號白油(石蠟油) 100ml
硬脂酸鋁 2g
司本80 6ml
混合加熱融化，分裝。用時按下列配方進行乳化。
油相 3份
水相（加4%吐温－80） 1份
先把油相攪拌起來，然後緩慢加入水相乳化。司本是油分散劑，吐温是水分散劑，均有利於乳化。
多克隆抗體技術乳化
將抗原與佐劑混合的過程稱為乳化。乳化的方法很多，可採用研缽乳化；可直接在旋渦振盪器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時，特別是弗氏佐劑與抗原乳化時，常採用注射器乳化，用兩個注射器，一個吸入抗原液，一個吸入佐劑，兩注射器頭以膠管連接，注意一定紮緊，然後來回抽吸。當大量乳化時，可採用膠體磨進行。
乳化好的標誌是取一滴乳化劑滴入水中呈現球形而不分散。如出現平展擴散即為未乳化好。乳化過的物質放置一段時間（在保存期內）出現油水分層也是未乳化好的表現。
根據抗原的性質、免疫原性和動物的免疫反應性來決定免疫途徑、免疫次數和間隔時間等。
免疫途徑包括皮下注射、皮內注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射以及淋巴結內注射等。抗原量少，則一般多采用加佐劑，淋巴結內或淋巴結周圍、或足掌、或皮內、皮下多點注射，如抗原量多，則可採用皮下、肌肉、以至靜脈注射。
注射間隔時間 帶佐劑的皮內、皮下注射，一般為間隔2～4周免疫一次。不帶佐劑的皮下或肌肉注射，一般為1～2周間隔時間；肌肉或靜脈免疫的，可5天左右的間隔時間。
可以把各種注射途徑聯合起來應用，最終以達到效價要求為目的。
多克隆抗體技術抗體的鑑定
多克隆抗體技術抗體的效價鑑定
不管是用於診斷還是用於治療，製備抗體的目的都是要求較高效價。不同的抗原製備的抗體，要求的效價不一。鑑定效價的方法很多，包括有試管凝集反應、瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗等。常用的抗原所製備的抗體一般都有約成的鑑定效價的方法，以資比較。如製備抗抗體的效價，一般就採用瓊脂擴散試驗來鑑定。
多克隆抗體技術抗體的特異性鑑定
抗體的特異性是指與相應抗原或近似抗原物質的識別能力。抗體的特異性高，它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應率來表示。交叉反應率可用競爭抑制試驗測定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率，求出各自在IC50時的濃度，並按下列公式計算交叉反應率。
如果所用抗原濃度IC50濃度為pg/管，而一些近似抗原物質的IC50濃度幾乎是無窮大時，表示這一抗血清與其他抗原物質的交叉反應率近似為0，即該血清的特異性較好。
多克隆抗體技術抗體的親和力
是指抗體和抗原結合的牢固程度。親和力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結合位點與抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。有助於維持抗原抗體複合物穩定的分子間力有氫鍵、疏水鍵、側鏈相反電荷基因的庫侖力、範德華力和空間斥力。親和力常以親和常數K表示，K的單位是L/mol，通常K的範圍在108～1010/mol，也有多達1014/mol。抗體親和力的測定對抗體的篩選，確定抗體的用途，驗證抗體的均一性等均有重要意義。
多克隆抗體技術抗血清的凍存
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