動物細胞培養反應器

攪拌式反應器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作範圍、良好的混合性和濃度均勻性，因此在生物反應中被廣泛使用。但由於動物細胞沒有細胞壁的保護，因此對剪切作用十分敏感，直接的機械攪拌很容易對其造成損害，傳統的用於微生物的攪拌反應器用作動物細胞的培養顯然是不合適的。所以，動物細胞培養中的攪拌式反應器都是經過改進的，包括改進供氧方式、攪拌槳的形式及在反應器內加裝輔件等。

一般情況下攪拌式反應器還常伴有鼓泡，為細胞生長提供所需氧分。由於動物細胞對鼓泡的剪胞生長提供所需氧分。由於動物細胞對鼓泡的剪切也很敏感，所以人們在供氧方式的改進上做了許多工作。籠式供氧是攪拌式動物細胞反應器供氧方式的一種，即氣泡用絲網隔開，不與細胞直接接觸；反應器既能保證混合效果又有儘可能小的剪切力，以滿足細胞生長的要求。北野昭一報道了一個經過改進的攪拌式動物細胞反應器，整體呈梨形，攪拌置於反應器底部，在攪拌軸外裝了一個錐形不鏽鋼絲網與攪拌軸一起轉動。軸心處的鼓泡管在絲網內側鼓泡，絲網外側的細胞不與氣泡直接接觸。

攪拌槳的形式對細胞生長的影響非常大，這方面的改進主要考慮如何減小細胞所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進，並在反應器內加裝了輔件，實驗證明改進後的反應器適用於對剪切力敏感的細胞進行高密度培養。反應器採用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳，頂部的法蘭蓋上安裝了3塊表面擋板。每塊擋板相對於徑向的夾角為30°，垂直插入液麪。擋板的存在減小了液麪上的旋渦。這個反應器維持了較小的剪切力，實驗中用於昆蟲細胞的培養，最終的培養密度達到6×106個/mL，成活率在98%以上。

攪拌式生物反應器用於動物細胞培養存在的最大缺點是剪切力大，容易損傷細胞，雖然經過各種改進，這個問題仍很難避免。相比之下，非攪拌式反應器產生的剪切力較小，在動物細胞培養中表現出了較強的優勢。

（1）填充牀反應器填充是在反應器中填充一定材質的填充物，供細胞貼壁生長。營養液通過循環灌流的方式提供，並可在循環過程中不斷補充。細胞生長所需的氧分也可以在反應器外通過循環的營養液攜帶，因而不會有氣泡傷及細胞。這類反應器剪切力小，適合細胞高密度生長。

（2）中空纖維反應器中空纖維反應器由於剪切力小而廣泛用於動物細胞的培養。這類反應器由中空纖維管組成，每根中空纖維管的內徑約為200μm，壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透過膜擴散，動物細胞貼附在中空纖維管外壁生長，可以很方便地獲取氧分。

（3）氣升式生物反應器氣升式生物反應器(airliftbioreactor)也是實現動物細胞高密度培養的常用設備之一，其特點是結構簡單，操作方便。有人在氣升式反應器中利用微載體培養技術，研究了Vero細胞高密度培養的工藝條件。證明氣升式反應器中懸浮微載體培養Vero細胞，在加入適量保護劑、營養供應充足的情況下，細胞可以正常生長至長滿微載體表面，終密度可達1.13×106個/mL。

生物反應器產業本身很難有每年達數十億元的產值，但其在生物技術產業鏈中卻起着再生產和擴大再生產的作用，達上百億元以上。有時一個新的生物反應器技術的應用和推廣，就可能促進某一生物技術產品的產業化形成，提高生產能力，或降低生產成本，可節約能耗達數十億元之巨。

用於生產的細胞和生物材料有微生物、動植物細胞、藻類、各種酶類等。不同細胞或酶有不同特點，因而有不同生物反應器設計要求。生物反應器種類有氣升式反應器和機械攪拌反應器；常規反應器和光生物反應器；好氧和厭氧反應器；液體深層培養反應器和固體發酵反應器；根據不同機械結構劃分的反應器；不同控制原理劃分的反應器等。此外，生物反應的規模也可由幾十毫升到上百M3不等。由此可見，很難規定幾個通用產品進行大批量生產，大多數用户根據自己的研究或生產特點，提出不同的定貨要求，反應器研製廠家必需有足夠的技術力量和經驗進行非定型化設計，以滿足用户要求。

具有先進的生物過程優化和放大能力是生物反應器設計的核心技術。由於在生物反應器中所發生的反應是在分子水平的遺傳特性、細胞水平的代謝調節和反應器工程水平的混和傳遞等多尺度（水平）上發生的。因此，如何利用生物反應器中的多參數檢測技術和在線計算機控制與數據處理技術，把細胞在反應器中各種表型數據與代謝調控有關的基因結構研究關聯起來，是反應器過程優化與放大的重要內容，也是當前國內外競相發展的具有原創性的知識產權技術，對促進生物技術產業化發展具有重要意義。由此可見，提供包含以上功能並具有自主知識產權的商品化生物反應器應是我國生物反應器產業的重點之一。

為了適應各種生物技術的實驗室成果向產業化轉化的需要，對生物反應器的性能要求愈來愈高，主要表現為：用於基因工程高密度高表達，符合GMP標準的生物反應器以及一些新技術的應用等。其中關於供氧問題，快速升温、SIP自動滅菌、CIP自動清洗、機械密封、排氣處理、取樣處理等問題以及培養液成份的流動注射分析（FIA）分析等都需很好解決。哺乳類動物細胞大規模培養是當前生產高附加值的糖基化活性蛋白醫藥產品的重要發展趨勢。根據動物細胞無細胞壁，對剪切極端敏感，在細胞生長控制上，要防止細胞分化和細胞凋亡，有時還要考慮對產品糖基化質量的要求。所以反應器要具備低剪切效應，混合性能好等特點，要提供細胞形態在線觀察和活細胞數量的傳感技術，嚴格控制反應器的操作條件以及有關防污染的灌注系統、取樣系統等都需要研究解決。用於細胞過程生理特性和過程傳遞特性研究的生物反應器研製，其中主要解決用於過程分析的各種傳感器選型研製和數據處理軟件包的研製。特別是近年來隨着微生物基因組測序和系統生物學研究工作的深入展開，發酵過程檢測與控測已經從基於參數傳感技術的反饋控制發展為以信息處理為基礎的生物過程檢測與分析。各種譜分析與生物反應器實驗數據關聯起來，提供各種表型數據具有重要意義。因而對反應器設計提出了新的要求。隨着生物技術在各領域的推廣應用，用於海洋藻類、微生物肥料、微生態飼料、環境污染處理等大規模細胞培養需要高強度低造價的生物反應器。特別是近年來利用生物質生產燃料乙醇等能源物質的戰略部署，需要應用大型高效節能生物反應器降低生產成本。

生物反應器是多專業技術發展的綜合體，由於反應器零部件技術的進步，必須及時更新產品設計，為用户提供性能更好且價格合理的反應器產品。這些零部件技術包括計算機軟硬件技術、各種傳感技術、反應器流型設計，新機械結構和材料等等。此外，隨着信息處理技術的發展，如何實現大批量數據處理、貯存與通信，把生物信息學與過程信息結合起來實現複雜生物系統的分析與控制，也以軟件包的形式逐漸從實驗室研究走向商品化。

作為商品化裝置的市場化，建立生物反應器生產標準，實施IS09001管理是發展生物反應器產業的重要內容，只有這樣才能提供合符用户要求及質量穩定的產品。主要內容有：產品裝置成套加工的工藝技術路線的確定與質量控制研究。在生物反應器製造過程中，如材料、焊接、表面處理、零部件機加工、外購件、易耗品…、直到安裝流程工藝、器材倉庫管理…等都要嚴格實施質量檢驗；原材料、半成品、成品標準等的確立與實施。如有關傳感器及一些如空氣過濾器、閥件、質量流量計等關鍵部件的測試標準的建立與研究，整機性能測試標準的建立與研究；產品質量過程控制程序的確立與實施等；整機性能測試標準的建立與研究。

由於生物反應器中的反應是在基因、細胞和反應器工程水平上多尺度發生的，因而真正利用生物反應器實現過程優化是有難度的，從理論到實踐的提高，並進一步在生物技術產品生產中發揮作用，需要有一個過程，應該把售前宣傳和售後服務等與整體應用技術提高結合起來才能取得好的效果。

動物細胞（雜交瘤細胞、CHO細胞、昆蟲細胞等）大規模培養技術及其生物反應器工程可廣泛應用於抗體、基因重組蛋白質藥物、病毒疫苗等生物技術產品的研究開發和工業化生產，華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室在動物細胞大規模培養技術及其生物反應器工程研究和開發應用方面，長期以來得到國家重大科技攻關計劃、863計劃等的大力支持，擁有一支精幹的研究開發團隊和一系列現代化設備儀器，建立了由無血清懸浮培養技術、培養過程及生物反應器設計放大與強化技術、大規模高密度流加和連續灌注培養技術、培養過程計算機實時監測與控制技術、病毒類產品大規模高效生產技術等核心技術組成的大規模動物細胞培養技術及其生物反應器工程平台。

1、動物細胞無血清懸浮培養技術

研製開發了多種適合於雜交瘤細胞、rCHO細胞、昆蟲細胞大規模懸浮培養過程的無血清/無蛋白培養基組成，成分明確，且細胞生長和產物表達水平與有血清培養基相當，成本比國外同類產品降低30%以上，其技術特點在於不僅能促進細胞生長、防止細胞損傷，而且還能支持細胞在大規模生物反應器中實現高密度培養，並有利於泡沫控制。

2、動物細胞培養過程及生物反應器設計放大與強化技術

與幾何放大、因次放大等經驗放大方法不同的是，本平台所擁有的動物細胞培養過程及生物反應器放大與強化技術是根據動物細胞大規模高密度培養過程的特點，在氣液傳質和流體力學等理論的指導下，在認識細胞與流體剪切力、細胞與氣泡相互作用機理的基礎上，其核心是採用機械攪拌和直接通氣鼓泡強化氣液傳質能力和流體混合條件，以使培養過程和生物反應器能支持108cell/ml以上細胞密度生長的能力，同時能有效消除流體剪切和氣泡對細胞的損傷與破損作用，實現放大過程中強化供氧混合與防止細胞破損的統一，使大規模細胞培養過程及其生物反應器能夠重複實驗規模的試驗結果，從而為動物細胞表達產品的工業化生產提供寬廣的放大與強化空間。同時，本平台也已具備100升以上規模高密度動物細胞培養過程及其各類生物反應器系統的研究設計和開發能力。

3、動物細胞大規模高密度流加和連續灌注培養技術

與已往連續流加和灌注培養技術不同的是，本平台所建立的動物細胞高密度連續流加和灌注培養技術的特點是通過調控細胞的生理狀態和代謝網絡，設計優化的培養基營養組成和流加、灌注技術，從而提高營養物代謝和能量利用率，降低有毒副產物生成，有效解決營養物耗竭和有毒副產物積累的矛盾，這樣可在相同培養基流加或灌注速率的條件下細胞密度可比現有流加或灌注培養技術提高四至五倍，上清夜中目標產物濃度可比傳統批式（Batch）培養提高六至十倍以上，生產過程產率和生物反應器生產能力則可同時提高數十倍，從而顯著提高細胞培養過程的經濟性，徹底改變傳統灌注培養方式只提高產量不提高經濟性的缺陷。

4、病毒類產品大規模高效生產技術

在病毒類產品工業化生產過程開發方面，現已建立起集生物反應器、微載體和動物細胞（Vero、BHK等）大規模培養技術為一體的人畜用病毒疫苗工業化生產技術，和以293細胞無血清懸浮培養技術為核心的病毒載體高效生產技術，不僅為病毒類產品的工業化生產解決了規模問題，徹底改變了傳統手工式和經驗式的滾瓶生產方式，而且通過研究和優化細胞生理狀態與病毒感染複製的關係，顯著提升工業化生產過程的經濟性。在50L生物反應器中批式培養上述細胞，其密度可達3×106cells/mL以上，灌注培養細胞密度可達1×107cells/mL以上，病毒滴度比傳統滾瓶工藝提高2至3個單位（相當於濃度單位2至3個數量級）。已能結合具體病毒類產品進行工業化生產過程的開發和優化。

5、培養過程計算機實時監測與控制技術

傳統動物細胞培養過程及其生物反應器能夠進行實時監測和控制的參數只有温度、攪拌轉速、溶解氧濃度（DO）和pH值等物理環境參數，而與細胞生理狀態和代謝活性相關的生理生化參數卻一概不能進行實時檢測和控制，與此不同的是本平台所建立的計算機實時監測與控制技術，是利用OUR（細胞耗氧速率）與細胞生長動力學、代謝動力學參數間的關係，通過計算機在線檢測培養過程中OUR的變化，以監測和控制培養過程中的細胞密度、細胞代謝活性、細胞生長速率、營養物代謝途徑和目標產物表達等生理生化關鍵參數，從而為動物細胞工業化培養過程的自動在線監測和控制奠定了基礎。

中國生物反應器的研究一直受到國家有關部門的重視，在國家攻關“七五”、“八五”期間先後立題，並集中國內有關單位攻關，解決了在生物反應器研製中的幾個關鍵技術問題，並形成了早期產品。但由於計劃經濟時代國家攻關計劃與產品開發脱節，再由於當時國內配套基礎差，以及各種體制和觀念上的問題，嚴重影響產品質量，故長期來未能在我國形成規模化的產業。中國商品化生物反應器的市場相當大的一部分被幾家國外公司佔領。主要有德國B.Braun、美國NBS、瑞士BioEngineering、日本丸菱以及韓國等，佔據了中國市場的70%左右以上。 近年來，國內有關生物反應器產業發展較快，有關產品生產的公司企業已達十多家，在這些公司的努力下，一改過去基本由國外產品統治國內市場的局面，特別在低端產品上已基本由國內控制。但是這些公司大都主要從事中低檔產品生產，企業技術力量以仿製為主，着重於以降低生產成本為目標的零部件替換研究，雖然產品的標準有所下降，但也能滿足一般用户的需要，特別對生物技術產業剛起步的或優化放大要求不高的企業或教學單位，低價的產品己可以適應他們的要求。但是對一些性能要求高的商品化生物反應器，如SIP自動滅菌與CIP清洗的全自動生物反應器、生物反應器的自動取樣與分析系統等，一些重要器件如耐高温滅菌的隔膜閥的抗疲勞、抗澎脹性以及器件加工工藝與標準都有差距，特別是一些符合GMP要求的高端生物技術產品所需的裝備或成套設備主要還是由國外公司提供。由於這些國內公司缺乏生物過程技術的研究力量以及工藝、工程、裝備一體化的研究體系，因而不能隨着生物技術發展有同步生物反應器的開發能力，例如對於大規模動物細胞生物反應器，至今國內還沒有符合要求的定型產品推出。此外，對與生物技術深度結合的高度自動化的實驗室裝置缺乏試製能力，因而只能是簡單的外型仿製和跟蹤，缺乏創新的自主知識產權產品。由此可見，面臨着生物技術的深入發展，如何解決提高生產能力為目標的行業技術改造，以及加入WTO後和國外高檔產品的市場競爭，我們必須大力開發具有自主知識產權的性能優越的反應器技術並商品化，以適應推動生物技術產業化的進一步發展需要。

1、以代謝流分析為核心的生物反應器

長期來發酵過程優化與放大所依據的基本思想和方法是採用經典動力學為基礎的最佳工藝控制點為依據的靜態操作方法，實質上這只是化學工程宏觀動力學概念在發酵工程上的延伸。例如，用氨水調節pH時，關心的是最佳pH值，卻不注意氨水加量的動態變化及其與其他參數的關係。在溶解氧濃度（DO）測量與控制時，關心的是最佳DO值或臨界值，不注意細胞代謝時的耗氧率。顯而易見，用在以活細胞代謝為主體的發酵過程就有很大的侷限性，應該重視細胞代謝流的存在。隨着過程傳感技術和計算機技術的發展，國家生化工程技術研究中心（上海）設計了一種用於生物過程多尺度研究的新概念發酵裝置（已由上海國強生化工程裝備有限公司組織生產，定型為FUS-50L（A）），該裝置以生物反應器中物料流檢測的觀點，具有十四個以上在線參數檢測或控制，並集中力量開發了一個適應多種反應器特點，融合多種過程理論和控制理論，便於發酵過程工藝分析和優化操作的軟件包。在鳥苷發酵過程中，從反應器測量參數上發現了細胞代謝流遷移，由此實現了過程優化。該產品先後成功地在青黴素、紅黴素、飼料金黴素、鏈黴素、黃黴素、泰樂黴素、棒酸、鳥苷、肌苷、基因工程白蛋白、基因工程瘧疾疫苗、基因工程植酸酶、胰島素原（PIP）、基因工程必特螺旋黴素等多種產品上發酵優化應用取得了大幅提高發酵單位能力，其優化結果一般可由幾十升發酵罐直接放大到上百立方的工業生產發酵罐。

2、動物細胞大規模培養生物反應器

研製由於細菌等原核細胞表達系統在轉錄及修飾方面的缺陷，許多重要價值的蛋白質，特別是基因工程藥物、疫苗、抗體等糖基化的需要，使哺乳類動物細胞表達系統成了一個更合適的工具，因此，哺乳類動物細胞表達系統引起了大家重視。以哺乳動物大規模培養技術為基礎的生物製藥產業在美國等西方國家得到了迅速發展，數十種產品已進入市場，取得了巨大的經濟和社會效益。國外用於生產的動物細胞生物反應器已趨於大型化（最大到噸級規模）、多參數與高度自動化的計算機控制系統、以及適應動物細胞對大型環境因子高敏感性的反應器精巧設計製造，並形成商品化供應用户。中國自“七五”至“八五”攻關期間立題開展有關動物細胞生物反應器研究，取得了較大進展，但哺乳類細胞培養技術要求高，技術壁壘大，有關公司在未能掌握核心技術的情況下，單憑模擬很難開展工作。抗體等其他細胞表達產品，裝藥量大，中國科研單位已經掌握的早期生物藥開發技術很難應用到新型藥物生產工藝上，需要重新摸索；由於細胞株等上游配套技術的落後、反應器研製技術的差距、以及有關缺乏生化工程的研究等原因，因而缺乏必要的條件去掌握高表達細胞株構建和大規模細胞培養技術，難以突破技術瓶頸，中國有關動物細胞生物反應器產業仍近乎空白。

3、帶pH測量與補料控制的搖牀──搖牀應用技術的發展

20世紀三十年代搖牀問世以來，搖牀就作為生物反應過程中必備的一種專用設備，用於微生物、動植物細胞菌種篩選、種子擴大培養等。由於搖牀設備的特點，不能實時測量培養過程中的有關參數以及過程補料控制，因此長期以來一直以搖牀的放瓶結果作為實驗數據。當用來作為諸如菌種生理特性變化、培養基成分的作用以及温度、pH等環境條件變化等研究的依據時,實際上是一種缺乏過程研究的靜態分析方法。這種方法的侷限性是很顯然的，例如以這種方法作為菌種選育後技術時，傳統搖瓶篩選方法往往缺乏補料或供氧不足，並不一定處於代謝流分配最合理的狀態，由此將出現嚴重的高產菌株漏篩現象。因此，國內外有關公司己注意開發帶pH測量的搖牀，並形成產品。

4、生物反應器中試系統設計

對於生產量大的傳統生物技術產品，為了對已經通過前期研究（實驗室研究和市場分析）的產品進行過程優化研究，在中試規模上達到高生產水平或質量，並進而為車間生產提供工藝放大依據和設備設計依據，必要時還可進行小批量生產，提供應用試驗樣品、或供市場銷售的部分產品。為此，近年來許多有關發酵產品生產的企業迫切需要建立一個多功能的中試發酵車間。

5、大型生物反應器設計與製造技術研究

幾十年來隨着發酵工業的快速發展，發酵工程趨向設備大型化、高效和自動化。以傳統生物技術產品來説，一些氨基酸、抗生素或發酵輕化工產品都在幾十到幾百M3以上發展，一些原來是小規模發酵罐的老廠搬遷新廠區，發酵罐的規模也普遍要求放大。基因工程產品一般附加值高，不需要大型生物反應器，但近年來隨着基因工程酶生產技術的發展，如基因工程植酸酶的研究成功，又由於飼料添加劑的需求量大，用於基因工程高密度高表達的大型生物反應器研製已勢在必行。特別是今後隨着礦物質能源的耗竭，利用生物質生產燃料乙醇等已提到重要戰略議事日程，高效節能的大型發酵裝置的應用是降低生產成本的不可缺少的關鍵技術，如美國、巴西等國家已達2000M3以上發酵裝置。