克隆植物

在植物界，克隆現象在自然界廣泛存在。秋海棠的葉片、馬鈴薯的塊莖、楊柳的枝條，都可以通過無性繁殖產生同自己一模一樣的後代。而些通常用有性生殖方式繁殖的植物，如水稻、小麥、玉米、高梁等主要糧食作物，能否用無性繁殖方式產生後代，克隆自身呢?生物工程用事實作了肯定的回答。

1958年，克隆植物的實驗就取得了重大成果。美國康乃爾大學的斯圖爾教授，用通常是用有性生殖方式繁殖後代的胡蘿蔔進行無性生殖試驗。他把胡蘿蔔的根部細胞打碎以後，用細胞激動素、生長素和無機鹽作營養結果這些細胞繁殖生根，得到的克隆胡蘿蔔，同一般胡蘿蔔長得一模一樣。採用這種技術，一個胡蘿蔔根就可以播幾十畝地。這種無性繁殖系的快速繁殖方法，在農業上得到廣泛應用。

1977年，我國四川生物研究所、廣東農業科學院、廣東甘蔗糖業食品科研所合作，試驗成功甘蔗試管育苗，培育出克隆甘蔗。他們為什麼要培育克隆甘蔗呢?原來，種植甘蔗一畝地需要蔗種500~1000千克，這是個不小的數目。要是用克隆技術來繁殖試管苗，繁殖一畝甘蔗只需很少點蔗種。須知，一根甘蔗上的細胞數目是一個天文數字。同樣，種植水稻小麥玉米高粱等穀物也需要大量的種子。假若主要糧食作物的種苗由用097克隆技術繁殖的試管苗來提供，那該有多好!科學家正為此努力工作着他們已培育出上百種克隆植物。

更為有趣的一些克隆植物試驗是在一些藥用植物上進行的。你們也許唱過一首朝鮮民歌:“賣花姑娘”。那悽婉的曲調、動人的歌詞，敍述一個小姑娘為了給媽媽買一種叫人蔘的藥材治病，賣了幾個月的花都未湊夠錢，眼睜睜地望着媽媽去世。人蔘是一種人所共知的珍貴藥材，能治很多病。可是，由於野生的人蔘資源越來越少，人工栽培的人蔘生長又十分緩慢，能不能讓人蔘細胞像細菌那樣迅速繁殖，在工廠裏規模化生產人蔘呢?

1964年，我國科學家羅士韋報道了人蔘試管苗培養獲得成功的消息。以後，日本、美國、前蘇聯、印度和我國的其他一些科學家也相繼報導了人蔘無性繁殖試管苗成功的新聞。在培育試管苗的基礎上，科學家們進一步試驗，將人蔘細胞放在發酵法生產抗生素一類的大型設備裏，用發酵罐批量生產人蔘。日本科學家在這方面的試驗獲得了較好的效果。他們進行了規模為13萬升的發酵罐試驗，生產出的人蔘和天然人蔘的成分幾乎是相同的。我國科學家丁家宜等人也進行了類似的成功試驗。這些成功的試驗，使藥物工作者激動不已。世界上使用的主要抗生素，都是用微生物發酵生產的。由於抗生素的副作用和病菌對抗生素耐藥能力的增加，科學家們正在努力尋找新的藥源。藥用植物是我國傳統的藥源，由於副作用小和很少發現對植物藥耐藥的病菌等優點，受到我國和全世界越來越多人的喜愛。但由於栽培時間長、名貴品種價值高昂、化學合成成本高等多種原因，科學家們渴望如克隆人參細胞那樣，將珍貴的藥用植物細胞在發酵罐裏大規模克隆。也就是説，借工業化大規模生產抗生素的方法生產中藥，這該是多麼了不起的一項發明。為了實現這一目標，我國和其他一些國家的科學家做了大量探索性的試驗。用組織培養和細胞培養方法培養成功的藥用克隆植物在100種以上，從培養物中產生可供利用的藥用成分在200種以上。其中，克隆植物藥用成分含量超過或接近原植物的有人蔘、三七、薯芋、柴胡、黃麻、煙草、決明、雲南蘿芙木、海巴戟、紫草、苦瓜、油麻藤、三分三等20多種。一旦這些技術應用到工業生產上去，實現大規模工業化生產，必將引起植物藥生產的重大變革。

克隆花卉植物，也是生物工程師們十分熱衷的事。中華民族是一個愛花的民族，在幾千年裏培育了許多著名的花卉植物，如十大名花：蘭花、梅花、牡丹、芍藥、荷花、茶花、杜鵑花、月季花、菊花、桂花等。國際市場上的花卉，很多都是引進中國原種培育成功的，比如，一些杜鵑和茶花的原產地就在中國。隨着人們温飽問題的解決，賞花這種追求精神享受的慾望強烈起來，花卉需求量與日俱增。在美國，每年菊花、月季花、蘭花等的銷售收入達4億多美元。以花卉之國著稱於世的荷蘭，每年栽培鬱金香、水仙等花卉的面積達1萬多公頃。須知，荷蘭是一個圍海造田起家、寸土寸金的彈丸小國。

為了生產更多價廉物美的高品位花卉供應市場，滿足人們對“美”的需求，生物工程師們開展了克隆花卉植物的研究。1960年，克隆蘭花首先獲得成功，蘭花試管苗問世。蘭花是一種高雅名貴的觀賞植物，全世界共有蘭科植物1.5萬種以上。蘭花在國際市場上價格很高，有的珍奇品種一苗即價值上萬美元。花農們使用克隆蘭花的先進技術，建立了龐大的蘭花工業，創造了上億美元的財富。已有上百種克隆蘭花問世。我國四川農業科學院的研究人員，用克隆技術培育成功號稱國蘭四大天王之一的“宋梅”和價值很高的川蘭名品：“銀杆春劍素”和“隆昌素”，試管苗已批量上市 ^[2]  。

克隆植物(clonal plant)是指在定居前期通過與母株相連的芽、分櫱或枝條等繁殖體產生無性繁殖的植物，這些繁殖體一旦定居便成為許多潛在的獨立個體。

植物克隆技術流程，植物克隆技術技術是是利用離體培養技術在試管內大量繁殖植物種苗的方法，它是將植株上的細胞或小塊組織（比如一塊葉片、一段莖節、一個芽、一個花蕾中一粒花粉等）在培養瓶中培養，在短短几個月時間內便能繁殖出成千上萬個新的植株。植物克隆技術優勢主要是快速、週年生產、變異小、無需種子繁殖等等。

植物克隆工廠是指利用環境控制和自動化技術進行植物全年生產的體系，包括無土栽培、植物克隆等技術以及植物細胞和組織培養的工業化產體系。1957年世界上第一工廠誕生在丹麥到1998年，日本有用於研究、展示、生產的植物工廠近四十個，其中生產用植物工廠17個。植物工廠建造雖未達到應用普及發展的時期，但其 出現預示着將來的發展前景。

植物克隆工廠，其生產採用全封閉的方式，嚴格實行全面和有效的控制環境及先進的植物工程技術，使生產到採收的全過程連續進行並高度自動化、流水化作業，實現全年連續的生產，完全擺脱了自然條件的限制。

培養基的製備：

1、 母液的配製和保存

為減少工作量一般將各種成分配成比所需濃度高10-100倍的母液，用時按比例稀釋。在配製大量元素無機鹽母液時，要防止在混合各種鹽類時產生沉澱，為此各種藥品必須在充分溶解後才能混合，同時在混合時要注意先後順序，把鈣離子、錳離子、鋇離子和硫酸根、磷酸根錯開，以免發生作用，相互結合生成沉澱。另外在混合各種無機鹽時，稀釋度要大，慢慢混合，同時邊混合邊攪拌。

配製好的母液分別貼好標籤，註明母液號、配製倍數、日期及配製1L培養基時應取的量。母液儲存於2-4℃的冰箱中。

2、 培養基的配製

（1） 稱取規定數量的瓊脂和蔗糖，加入一定量的蒸餾水，加熱使其溶解。

（2） 在燒杯中加入規定量的各種母液，包括生長調節物質和其他的特殊補加物。

（3） 將母液混合物加入融化的瓊脂中，再加入糖類物質，定容至所需體積，攪勻。

（4） 用1mol/L的氫氧化鈉和鹽酸調節pH值。

（5） 趁熱將培養基分裝到所選用的培養容器中。

（6） 用棉塞或封口膜蓋住瓶口。

（7） 在121-126℃滅菌15-20min。

（8） 滅菌後，待壓力歸零後將培養基取出讓其凝固。

材料的消毒與接種：

1、 材料的選擇和確定

不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的，因此，在取材時要充分考慮季節的影響、器官的生理狀態和發育年齡、取材的部位以及材料的大小。

2、 材料的消毒

一般材料先用自來水沖洗，再用70%的酒精浸泡數秒，倒去酒精，再用0.1%的昇汞溶液或2-10%的次氯酸鈉溶液浸泡10-15min，後用無菌水沖洗3-5次。

3、 接種

將材料切成所需的形狀和大小，接入培養基中。

初代培養、繼代培養、生根與移栽：

1、 初代培養

在初代培養基上，外植體經不同的途徑可以誘導出愈傷組織、直接分化出芽或誘導出胚狀體。

2、繼代培養

將初代培養產物轉入繼代培養基上，使愈傷組織分化出叢生芽、不定芽繼續增殖、胚狀體發育成完整植株。

3、 生根

將健壯的試管苗插入生根培養基中，誘導根的形成。

4、 試管苗的移栽

打開瓶蓋，逐漸降低濕度，並逐漸增強光照，進行馴化，以適應環境，經過一段時間的煉苗即可移入盆中。

將植物的細胞或組織從個體上分離出來，在一定條件下進行離體培養，使之形成細胞團或愈傷組織，然後再培養分化器官，形成再生植株(即植物細胞全能性的表達)，這種由一個親本經無性繁殖形成的生物體，其基因組與親本完全或基本相同，這樣形成的植物稱克隆植物。植物細胞和組織培養是植物克隆技術的基礎，是植物生理學、細胞生物學和生物技術的有關理論和技術方法及其在生產上的應用。具體地説，用離體細胞進行培養稱細胞培養，而用離體組織進行培養稱組織培養。但通常不論是用細胞、組織、器官甚至用部分個體為材料，只要利用離體培養技術方法進行培養，都可統稱為組織培養。

植物細胞和組織培養可與各種細胞操作和遺傳操作相結合，來定向改變農作物的性狀，提供選育新品種的材料，還可進行無性系快速繁殖等研究 ^[3]  。

研究生物在其環境內的最適生活史格局、生殖配置、生殖值、生殖產量以及生殖對策及其相互關係是濕地克隆植物生態適應性與進化生態學的重要內容。有些濕地植物具有密叢型的生態特點，這是對過濕土壤和氧氣供給不足環境的一種適應方式。在5-9月的生長季中，毛果苔草是以Ⅰ齡分櫱株最多，其次是Ⅱ齡分櫱株，Ⅲ齡以後明顯減少，説明Ⅲ齡以後毛果苔草雖然具有再生繁殖能力，但因生活力弱而難以成活。毛果苔草生殖分櫱植株的生物量以工齡為最大，並隨着年齡的增加而呈現減少的趨勢，表明生殖分櫱植株是以工齡級的生活力最強，至Ⅲ齡級時急劇減弱。但Ⅱ齡級和Ⅲ齡級繁殖分配比均比Ⅰ齡級大，營養元素在生殖器官的分配比的順序是：K>Ca>P>N>Mg>Mn>Zn>Cu>Fe；毛果苔萆對不同營養元素利用效率(NUE)的順序是：K>N>Mn>P>Fe>Ca>Zn>Cu>Mg。因此，鉀元素可能就是毛果苔草有性生殖的最重要的限制因子，即鉀對毛果苔草的有性生殖的影響最大。掘此提出營養元素對克隆植物有性繁殖的“瓶頸效應”這一區域養分限制的觀點 ^[4]  。

克隆植物通過體內激素平衡的變化，調節頂端分生組織和側生分生組織的活動強度，控制克隆植物生長型的變化。頂端分生組織活動主要是產生較長的節間，提高匍匐莖生長速率；側生分生組織活動主要是形成新分枝，控制分枝的數量、位置和角度，決定分枝格局的形狀和複雜性。分生組織的活動主要受植物激素(主要是生長素IAA、細胞分裂素iPA及其比例)的調節。生長素誘導細胞伸長，增大節間，促進頂端分生組織活動和頂芽生長，提高匍匐莖和根莖的生長速率。細胞分裂素促進細胞分裂和側生分生組織的活動，促進側芽生長，控制分枝數量和位置。較大的IAA/iPA比值促進頂端分生組織活動，抑制側生分生組織，形成較長的節間和匍匐莖，分枝稀少，克隆表現為遊擊型的生長型，如漂筏苔草等；較小的lAA/iPA比值促進側生分生組織活動，抑制頂端分生組織，促進側芽形成，產生大量分枝，匍匐莖的生長受到抑制，這樣克隆株系表現為集團型的生長型，如毛果苔草、狹葉甜茅等 ^[5]  。