小干擾RNA

小干擾RNA（siRNA），有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，是一類雙鏈RNA分子，長度為20-25個鹼基對，類似於miRNA，並且在RNA干擾（RNAi）途徑內操作。它干擾了表達與互補的核苷酸序列的特定基因的轉錄後降解的mRNA，從而防止翻譯。

siRNA由雙鏈RNA (double strand RNA，dsRNA) 在細胞內被RNase III (如Dicer) 切割成21～25bp大小的雙鏈RNA。dsRNA可以是外源的，如病毒RNA複製中間體或人工導入的dsRNA；也可以是內源的，如細胞中單鏈RNA在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下形成的dsRNA 。 ^[1] 

siRNA最早是由英國的大衞·包孔博（David Baulcombe）團隊發現，是植物中的轉錄後基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）現象的一部分，其研究結果發表於《科學》。2001年，湯瑪士·塗許爾（Thomas Tuschl）團隊發現合成的siRNA，可誘導哺乳動物體內的RNAi作用，結果發表於《自然》 ^[3]  。這項發現引發了利用可控制的RNAi，來進行生物醫學研究與藥物開發的方法。

siRNA具有明確定義的結構：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）雙鏈RNA（dsRNA）和具有兩個突出核苷酸的羥基化3'末端。該切酶酶催化生產的siRNA由長的dsRNA和小發夾RNA。siRNA也可以通過轉染引入細胞。由於原則上任何基因都可以被具有互補序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在後基因組時代驗證基因功能和藥物靶向的重要工具。

siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙鏈RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結構是利用一種稱為dicer的酶處理而得，這種酶可以將較長的雙鏈RNA或小發夾RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可經由多種不同轉染（transfection）技術導入細胞內，並對特定基因產生具專一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用經過適當剪裁的siRNA之互補性，來對已知序列的基因進行標定，這種現象使siRNA成為研究基因功能與藥物目標的一項重要工具。

1.長dsRNA（可來自發夾，互補RNA和RNA依賴性RNA聚合酶）被稱為Dicer的內切核糖核酸酶切割。Dicer切割長dsRNA以形成短干擾RNA或siRNA；這使得分子能夠形成RNA誘導的沉默複合物（RISC）。

2.一旦siRNA進入細胞，它就會被整合到其他蛋白質中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC複合物的一部分，siRNA就展開以形成單鏈siRNA。

4.由於其在5'末端的鹼基配對而在熱力學上較不穩定的鏈被選擇作為RISC複合物的一部分。

5.作為RISC複合物一部分的單鏈siRNA現在可以掃描並找到互補的mRNA。

6.一旦單鏈siRNA（RISC複合物的一部分）與其靶mRNA結合，它就會誘導mRNA切割。

7.現在切割mRNA並被細胞識別為異常。這導致mRNA的降解，並且反過來不將mRNA翻譯成氨基酸然後轉化為蛋白質。從而沉默編碼該mRNA的基因。

siRNA也類似於miRNA，然而，miRNA來自較短的莖環RNA產物，通常通過抑制翻譯來沉默基因，並且具有更廣泛的作用特異性，而siRNA通常通過在翻譯前切割mRNA而起作用，並且具有100%的互補性，因此目標特異性非常嚴格。 ^[2] 

通過轉染外源siRNA進行的基因敲低通常是不令人滿意的，因為該效應僅是短暫的，特別是在快速分裂的細胞中。這可以通過產生siRNA的表達載體來克服。修飾siRNA序列以在兩條鏈之間引入短環。得到的轉錄物是短髮夾RNA（shRNA），其可以通過Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的轉錄盒使用RNA聚合酶III啓動子（例如，U6或H1）來指導小核RNA（snRNA）的轉錄（U6參與基因剪接；H1是RNase）人RNase P）的成分。理論上，所得的siRNA轉錄物然後由Dicer處理。

通過使用細胞擠壓也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取決於其與RNA誘導的沉默複合物（RISC）的結合能力。雙鏈體siRNA與RISC的結合之後是用內切核酸酶解開和切割有義鏈。然後剩餘的反義鏈-RISC複合物可以與靶mRNA結合以啓動轉錄沉默。

已經發現dsRNA還可以激活基因表達，這種機制被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa。已經顯示靶向基因啓動子的dsRNA誘導相關基因的有效轉錄激活。使用合成的dsRNA在人細胞中證明RNAa，稱為“小活化RNA”（saRNA）。尚不清楚RNAa是否在其他生物體中是保守的。

siRNA誘導的轉錄後基因沉默始於RNA誘導的沉默複合物（RISC）的組裝。該複合物通過切割編碼靶基因的mRNA分子來沉默某些基因表達。為了開始該過程，兩條siRNA鏈中的一條（引導鏈）將被裝載到RISC中，而另一條鏈即過客鏈被降解。某些Dicer酶可能負責將引導鏈加載到RISC中。然後，siRNA掃描並指導RISC到mRNA分子上完全互補的序列。認為mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi結構域催化。然後通過切割與siRNA殘基10和11配對的靶核苷酸之間的磷酸二酯鍵精確切割mRNA分子，從5'端開始計數。這種切割導致mRNA片段被細胞核酸外切酶進一步降解。5'片段通過外來體從其3'末端降解，而3'片段從其5'末端通過5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割後靶mRNA鏈與RISC的解離允許更多的mRNA被沉默。這種解離過程很可能是由ATP水解驅動的外在因素促進的。

有時不會發生靶mRNA分子的切割。在一些情況下，磷酸二酯骨架的核酸內切裂解可以通過切割位點附近的siRNA和靶mRNA的錯配來抑制。其他時候，即使靶mRNA和siRNA完全配對，RISC的Argonaute蛋白也缺乏內切核酸酶活性。在這種情況下，基因表達將被miRNA誘導機制沉默。

Ping-Pong方法的簡化版本，涉及蛋白質Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA負責轉座子的沉默，而不是siRNAs。

siRNA設計(3張)

最初，siRNA序列的選擇是基於實驗經驗而獲得的（Elbashir et al. 2001，2002）。最近，生物信息學工具被用來設計siRNA（表18-1），目前多個數據庫收錄了經過實驗確證的siRNA和shRNA。值得推薦的是，在設計新的siRNA之前可以通過搜索已有的siRNA數據庫和科研文獻來尋找已確證的siRNA。如果不能獲得已確證的siRNA，則應該為每個靶基因設計3~5條候選siRNA（Pei and Tuschl 2006）。以下將介紹如何挑選有效和特異性強的siRNA。有關siRNA設計的詳細過程請參考Birmingham等（2007）的研究。

1、目標區域。siRNA通常以mRNA的CDS序列為靶點，因為一般認為，相對非編碼序列而言，CDS序列容易成為RNA干擾的靶點且多態性更低。然而，當CDS不容易找到合適的siRNA結合位點，或者為了區分兩個編碼區相同但3'非翻譯區（UTR）不同的基因時，3'端UTR也可以利用。5'端UTR和剪接點通常不被考慮，因為它們可能會被細胞內蛋白質複合體（如翻譯起始機器或者外顯子連接複合體）所包裹。

2、長度和非配對結構。儘管20~25個核苷酸長度、包含2個非配對鹼基形成的3'端突出“尾巴”的雙鏈siRNA顯示出了與常規siRNA相當的效率，但常規的雙鏈siRNA依然是長度為21個核苷酸、兩端包含2個非配對鹼基形成的3'端突出“尾巴”，模擬了Dicer酶體內切割的主要產物。長度超過30個鹼基的雙鏈RNA能夠在哺乳動物體細胞中誘導干擾素反應。一些長度超過23個鹼基的RNA雙鏈體能夠誘導細胞特異性的干擾素反應（Reynolds et al. 2006）。

3、熱力學不對稱性。進入RISC的siRNA鏈被稱為“嚮導鏈”（圖18-2）。這一siRNA鏈的5'端鹼基配對較為鬆弛（動力學穩定性稍差），被RNA干擾機器識別為嚮導（Khvorova et al. 2003；Schwarz et al. 2003）。嚮導鏈進入RISC，兩者之間的這種結合會通過5'端的G∶U錯配得到加強。反之，也可以通過化學修飾減弱信使鏈（嚮導鏈的反義鏈，目標mRNA的同義鏈）與RISC的結合（Nykanen et al.2001；Chen et al. 2008）。

4、GC含量和核苷酸偏好。有關siRNA設計的大量分析顯示：具有生物學功能的siRNA不能含有迴文（palindromic）序列和內在重複序列，並且GC含量達到30%~52%。迴文序列或者內在重複序列會形成二級結構，干擾與RISC以及目標mRNA的結合（Patzel et al. 2005）。GC含量過高或者過低會干擾兩條siRNA鏈的分離，減慢與RISC的結合。此外，成熟RISC與目標mRNA的強烈結合會妨礙切割產物的釋放，使酶的轉換效率降低（Haley and Zamore2004；Tang and Zamore2004）。有關高效siRNA性質的多因素分析顯示：嚮導鏈的第1~第7個鹼基應該是U或者A，第10個鹼基應為A或者U，第19個鹼基應為G或者C（Pei and Tuschl 2006）。這些“規律”預示了嚮導鏈的結合喜好，使其與靶標保持適當的親和力，促進對靶標的多輪切割。

5、RNA干擾介導的脱靶效應。RNA干擾介導的脱靶效應是指雙鏈siRNA的嚮導鏈或信使鏈介導的對基因表達的非特異性抑制，具有濃度依賴性（圖18-3）（Jackson et al. 2006a）。RNA干擾介導的脱靶效應通常會在siRNA發揮類似內源性miRNA的作用時發生，即通過小RNA嚮導鏈的“種子序列”（2~7位或2~8位核苷酸）與其目標mRNA結合（Lim et al. 2005；Lin et al. 2005；Birmingham et al. 2006）。目前已經有多種消除這種脱靶效應的方法。儘管通過同源性搜索（如BLASTn或者Smith-Waterman算法）來減少可能存在脱靶效應的siRNA的方法應用比較廣泛，但這一方法仍不能消除大多數的脱靶效應，這是因為無法避免第6位和第7位核苷酸與細胞內mRNA匹配的偶然情況。通過將針對同一mRNA的多個無相關性siRNA混合使用以降低每一種siRNA濃度的方法可提高RNA干擾的特異性（Kittler et al. 2007），但是這種方法有着嚴格的適用要求。對siRNA嚮導鏈的第2位核苷酸進行不依賴於序列的化學修飾同樣可以提高效率，這一方法減少了siRNA對既定靶標以及靶標之外mRNA的親和力（Jackson et al. 2006b）。唯一被證實的可提高RNA干擾特異性的方法是設計siRNA分子，使其正確的RNA鏈進入有功能的RNAi酶複合體，或者可以對信使鏈進行化學修飾，以阻止其通過RNA干擾途徑發揮作用（Elménet al. 2005）。

6、天然免疫反應和毒性。在哺乳動物中，如果siRNA包含富含G和U的序列基序，如GUCCUUCAA或者UGUGU，那麼此siRNA有可能通過Toll樣受體激活細胞內的天然免疫通路（Hornung et al. 2005；Judge et al. 2005；Marques and Williams 2005；Sioud 2005）。然而，其他的免疫刺激因素仍然有待鑑定，因為有一些siRNA雖富含G和U卻不能激活免疫受體，而另一些缺少GUCCUUCAA或者UGUGU基序的siRNA反而具有免疫刺激活性。針對176個隨機挑選的siRNA進行比較研究，鑑定出UGGC是一個毒性基序，能引發細胞死亡（Fedorov et al. 2006）。已知的免疫刺激活性和毒性基序可以通過計算預測而避免。另外，化學修飾，如鎖狀核酸（locked nucleic acid，LNA）（圖18-4）和對免疫刺激活性和毒性基序進行2'-O-甲基化核酸修飾可以用於抑制其天然免疫刺激活性（Judge et al. 2006）。 ^[4] 

合成siRNA應用廣泛，這種方法的得率和純度都比較高。對合成siRNA還可以進行一系列化學修飾以提高siRNA的穩定性、降低脱靶效應，以及（或者）阻止激活天然免疫反應。多家公司，包括Ambion、Thermo Scientific Dharmacon、QIAGEN和Sigma-Aldrich Proligo等都能提供高質量的合成siRNA。在用於細胞之前，合成的正義和反義siRNA需在體外復性形成雙鏈siRNA（方案1）。

利用重組Dicer酶或者細菌RNase Ⅲ對體外轉錄獲得的長鏈dsRNA進行酶學消化也可以獲得雙鏈siRNA（Yang et al. 2002）。與合成siRNA相比，對長鏈dsRNA酶消化可以生成不同種類的siRNA，提高了生成功能性siRNA的可能性。然而，體外酶學反應生成siRNA的主要不足之處在於：這些siRNA在使用時不易選擇對照。理論上，對照siRNA不應該與實驗siRNA具備相同的種子序列。由於體外酶切生成的確切siRNA無從得知，那麼也就無法選擇精確的對照，因此，無法區分究竟是既定靶標mRNA還是脱靶基因的特定表型表達發生下調。

利用合成的、含有噬菌體啓動子的DNA寡核苷酸模板，經體外轉錄可以生成siRNA。通常，這一方法通過核酸酶或者核酶消化，確保產物擁有確定的末端以及（或者）5’端單磷酸或者羥基末端。這一方式能夠以較低成本快速生成多個不同siRNA，但是風險主要存在於污染的三磷酸RNA會觸發天然免疫反應（Kimet al. 2004）。 ^[4] 

近年來，RNAi技術在病毒感染性疾病治療方面的應用已受到極大關注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等治療中的應用研究最為活躍。，在siRNA抗AIDS的研究中，針對HIV結構蛋白基因及長末端重複序列（longterminal repeat，LTR）的SiRNA可以控制病毒複製；針對宿主細胞HIV受體CD4基因的siRNA可有效控制病毒進入宿主細胞，抑制病毒的感染過程。但CD4是人體正常免疫功能不可缺少的分子，它的表達抑制勢必影響正常的免疫功能，由此設想針對CCR5、CCR4等共同受體設計siRNA，並正在試驗中。另外在抗病毒治療中，分別以丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、脊髓灰質炎病毒等基因組的編碼區或非編碼區為靶點設計的siRNA均取得了令人欣喜的體外抑制作用，但利用動物實驗模型驗證siRNA體內清除病毒的效果需進一步研究。 ^[1] 

雖然RNAi有望成為抗病毒治療的有效工具，但病毒株靶基因的高度突變或鹼基丟失，如HIV和流感病毒，成為設計siRNA時必須考慮的問題。另外一種稱為病毒抑制子蛋白的發現使研究人員對RNAi的抗病毒效應有了更深的認識，研究發現這種病毒抑制子由病毒基因組編碼產生，最初在植物中發現，有報道別的真核生物中也存在，其與RNA干擾裝置競爭性的結合，通過阻斷siRNA的加工或干擾信號的傳遞等途徑抑制RNA干擾，從而降低其抗病毒的效應。 ^[1] 

針對上述影響因素，在RNAi抗病毒的治療應用中，（1）靶序列的選擇最好是針對病毒的保守序列，以減少病毒變異的影響。（2）設計針對不同靶序列的多種SiRNA並聯合作用，以減少病毒逃逸的產生。（3）針對病毒進入細胞或病毒複製相關的宿主基因設計siRNA，如HIV受體CD4、CCR5等，這樣即使病毒高度變異，其逃逸RNA干擾的幾率也會大大降低。（4）針對病毒抑制子設計siRNA，可在一定程度上減少或避免病毒抑制子的產生，並且隨着對RNA干擾的深入研究，將會有越來越多的相關報道。綜上所述，RNAi在抗病毒治療應用方面雖取得很大的突破，但其應用於臨牀還有待更深的研究。 ^[1]