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TUNEL檢測
鎖定
基因組DNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ,從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測,這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。
- 中文名
- TUNEL檢測
- 外文名
- TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling
目錄
- 1 原理
- 2 實驗方法
- ▪ 對於貼壁細胞或細胞塗片
- ▪ 對於懸浮細胞或細胞懸液
- ▪ 對於石蠟切片
- ▪ 對於冷凍切片
- ▪ 配製TUNEL檢測液
- ▪ 對於貼壁細胞、細胞塗片或組織切片
- ▪ 對於懸浮細胞或細胞懸液
- 3 常見問題
- ▪ 出現非特異性熒光標記
- ▪ 熒光背景很高
- ▪ 標記效率低
- 4 例圖
TUNEL檢測原理
細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ,從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測,這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。
TUNEL檢測實驗方法
TUNEL檢測對於貼壁細胞或細胞塗片
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細胞貼得不牢,可以乾燥樣品使細胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧雲天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS,冰浴孵育2分鐘。
f. 轉步驟5。
TUNEL檢測對於懸浮細胞或細胞懸液
a. 收集細胞(不超過200萬細胞),PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團,宜在側擺搖牀或水
平搖牀上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細胞,冰浴孵育2分鐘。
e. 轉步驟5。
TUNEL檢測對於石蠟切片
a. 二甲苯中脱蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯,再脱蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘,蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K,20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用温度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意:這一步必須把蛋白酶K洗滌乾淨,否則會嚴重干擾後續的標記反應。
d. 轉步驟5。
TUNEL檢測對於冷凍切片
a. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次,每次10分鐘。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS,冰浴孵育2分鐘。
d. 轉步驟5。
TUNEL檢測配製TUNEL檢測液
參考下表配製適當量的TUNEL檢測液,需充分混勻。注意:配製好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢,不能凍存。
1個樣品 | 5個樣品 | 10個樣品 | |
TdT酶 | 2μl | 10μl | 20μl |
熒光標記液 | 48μl | 240μl | 480μl |
TUNEL檢測液 | 50μl | 250μl | 500μl |
TUNEL檢測對於貼壁細胞、細胞塗片或組織切片
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液,37℃避光孵育60分鐘。注意:孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤,以儘量減少TUNEL檢測液的蒸發。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
TUNEL檢測對於懸浮細胞或細胞懸液
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液,37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或塗片後在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長範圍為450-500nm,發射波長範
圍為515-565nm(綠色熒光)。
TUNEL檢測常見問題
TUNEL檢測出現非特異性熒光標記
a. 有些細胞或組織,例如平滑肌細胞或組織,nuclease或polymerase的酶活性水平較高,易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是,取細胞或組織後立即固定並且要充分固定,以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當的固定液,例如一些酸性固定液,導致出現假陽性。建議採用推薦的固定液。
TUNEL檢測熒光背景很高
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
b. 高速分裂和增殖的細胞,有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
TUNEL檢測標記效率低
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長,導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時,如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光,從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色,例如0.5μg/ml碘化丙啶。
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TUNEL檢測例圖
作者自制,不得移做他用!
- 參考資料
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- 1. TUNEL法-百度文庫
- 詞條統計
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