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重疊延伸剪接術( splicing by overlap extension)：兩個基因的 PCR產物之間有 20bp 左右的重疊區域 ,把兩個 PCR產物混合作為模板 ,以上游基因的上游引物和下游基因的下游引物進行 PCR 。由於採用具有互補末端的引物， 使PCR產物形成了重疊鏈， 從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸， 將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用 PCR 技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連接酶處理， 可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。重疊延伸PCR 技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計。重疊延伸PCR 在基因的定點突變、 融合基因的構建、 長片段基因的合成、 基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應用。

重疊延伸剪接PCR法共用4條引物(外側引物a、d及突變引物b、c，其中b、c含有相同的突變點並互補)，進行兩輪PCR反應。在第一輪反應中外側引物a與突變引物b產生產物AB，突變引物c與外側引物d產生產物CD，因為引物存在着互補，AB和CD兩者之間存在一段重疊區，能夠互為模板相互延伸形成突變體，然後以此為模板，在外側引物a、d的引導下合成、擴增大量帶有目標突變的終產物AD。 ^[1]