重疊延伸PCR

重疊延伸 PCR 的原理並不複雜，如果有 2 個基因或者一個基因和一個終止子，要將它們連接到一起，最先想到的是藉助於限制酶切和 DNA 連接酶的方法，但有時並不一定能找到合適的酶切位點，或者找到了，但該酶又非常昂貴。且可能只用一次，在這種研究背景下，重疊延伸 PCR 技術就應運而生了 ^[2]  。

比如有 2 個基因，一個命名為M。一個命名為 N，基因 M 和 N 序列如下所示 ^[2]  ：

M：5’一ATGCATGCTAGCTAGAACG—CTACGCTGACTACCCCCTGATC一3’

N：序列為5’一ATGCTAGTAGCTAGCCCCC—CCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG一3’

要將它們連接到一起，首先必須要設計引物，假設引物的序列為 ^[2]  ：

M1：5'一ATGCATGCTAGCTAGAACGCT一3’

M2：3’-TGCGACTGATGGGGG-ACTAGTACGATCATCGATCGGGGGG-5'

N1：5’一ACGCTGACTACCCCCTGATCATGCTA—GTAGCTAGCCCCCC一3’

N2：5’一CGTTTAAAAAATTATCCCCT一3’

該過程的目的是將基因 M、N 通過 PCR 的方法連接起來，觀察上面的引物 M2 和 N1，會發現它們要比另外2 條引物長很多，這是因為在設計的時候將 M2 的 3’端加入了 20 個 N 基因 5’ 端的序列，在 N1 的 5’ 端加入了 20個 M 基因 3’ 端的序列，然後再進行如下相關步驟 ^[2]  ：

①以M1、M2擴增M基因，N1、N2擴增N基因 ^[2]  。

②回收M、N基因 ^[2]  。

③以M、N為共同的模板，M1和N2為引物，擴增M+N，這樣就將M+N拼接起來了 ^[3]  。

對引物的分析如下：這裏關鍵的2個引物是M2和N1。可以看出，M2的5’端前20個鹼基與N序列5’端的前20個鹼基互補，而M2的後20個鹼基與M序列的3’端的前20個鹼基互補。N1的5'端前20個鹼基與M序列的3’端前20個鹼基相同，即與M基因的另外一條鏈互補，N1的後20個鹼基與N序列5’端的前20個鹼基相同，即與N基因的另外一條鏈互補。M1和M序列的5'端前21個鹼基相同。N2和N序列的3’端前21個鹼基互補 ^[3]  。

重疊互補引物的設計是重疊延伸PCR技術成功的關鍵。相連引物間的重疊區域以15-20個鹼基為宜，重疊區域中應儘量避免富含 AT(ATTTA，AATAA、AATTAA等) 的序列，因為在片段合成過程中，接頭區富含AT的區域極易發生錯配 ^[1]  。

為了最大限度地避免鹼基的錯配，重疊延伸 PCR 反應應避免使用普通 Taq酶，因為 Taq酶會在 PCR 產物末端加 A，從而可能會使產物移碼突變。一般採用高保真 DNA 聚合酶 ^[1]  。

對於重疊延伸 PCR 反應，循環不宜過多，變性的温度也不宜過高，時間不宜過長。高温會使 DNA 受到損傷，造成 DNA 酶終止合成。考慮到DNA 聚合酶的擴增效率、錯配率，每一輪反應的循環數控制在 20-25 個為宜。循環次數過多，鹼基錯配的幾率增大；循環次數太少，則得不到足夠的拷貝數進行下一輪反應。反應的退火温度也要根據引物而定，在保證產物擴增效率的前提下，應儘量提高退火温度以提高產物的特異性，為下一輪PCR反應提供高質量的模板，從而降低反應的錯配率 ^[1]  。

採用一段已知的500—600 bp鹼基的DNA片段為PCR模板，根據所要合成的DNA序列可以設計一系列的PCR嵌合引物對(即鹼基互補配對)，長度為50—60 bp，且從5’到3’方向順序重疊，重疊鹼基數目為25—30 bp，通過多重PCR全部引物疊加所得到的DNA正是自己所要合成的長片段DNA ^[1]  。

以融合A和B兩基因為例，A、B兩基因可以相同也可以不同，先分別用al、c1和a2、c2兩對引物擴增出A基因和B基因，然後再用al和c2將兩基因連接起來，得到A、B的融合基因。也可以設計多對引物，融合多個基因。重疊延伸PCR可將任意的兩個目的基因拼接連接，中間無任何目的基因以外的其他DNA序列，這樣就可避免因加入連接序列可能出現的表達蛋白質的功能異常 ^[1]  。

基因突變技術是蛋白質工程中應用的重要技術之一，可以有目的地改變DNA序列中的鹼基，從而闡明基因表達的調控機理，研究蛋白質結構與功能間的關係，改造天然蛋白質，使之更符合應用需求。重疊延伸PCR技術可以在DNA片段的任意部位產生定位突變。它在需要誘變的位置合成兩個帶有變異基因鹼基的互補引物(如引物b和引物c)，然後分別與5’引物和3’引物(引物a和引物d)作PCR，這樣得到的兩個PCR產物分別帶有變異鹼基，並且彼此重疊，在重疊部位經重組PCR就能得到誘變的PCR產物。任何基因，只要兩端及需要變異的部位的序列已知，就可用PCR誘變去改造基因的序列。方法簡便易行，結果準確、高效，因此已成為最常用的定位誘變方法 ^[1]  。

1.同常規PCR相比，重疊延伸PCR技術無疑具有更廣闊的應用前景。經過十幾年不斷的實踐與總結，重疊延伸PCR方法的體系已日趨成熟，成為分子生物學研究中的常用方法。重疊延伸PCR已在許多研究領域發揮重要作用 ^[1]  。

2.但是，作為一種沒有標準化反應條件的技術體系，重疊延伸PCR技術在應用過程中還存在很多問題需要解決，例如最合適的引物長度、最佳連續延伸的循環數等。這些問題還需要進行系統的研究，才能為該技術的應用提供更有力的理論支持 ^[1]  。