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northern印跡雜交
鎖定
- 中文名
- northern印跡雜交
- 外文名
- Northern blot
- p H
- 高於4.0
- 關聯技術
- Western blot
northern印跡雜交簡介
Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得並不牢固，所以在轉印後用低鹽緩衝液洗脱，否則RNA會被洗脱。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之後將標記物切下、上色、照相，樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要儘可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。
瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。
原理：
整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達，則轉化植株細胞內有其轉錄產物——特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子質量大小依次排布在凝膠上；將他們原位轉移到固定膜上；在適宜的離子強度及温度條件下，用探針與膜雜交；然後通過探針的標記性質檢測出雜交體。若經雜交，樣品無雜交帶出現，表明外源基因已經整合到植物細胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態下該基因並未有效表達。
northern印跡雜交RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法
northern印跡雜交試劑
甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風櫃中操作，pH高於4.0。
20×SSC；
去離子甲酰胺；
50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；
0.1mol/LTris，pH7.5。
northern印跡雜交步驟
[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7 ml 10×MSE緩衝液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻後倒入盛膠槽。
[2]等膠凝固後，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。
[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。
[5]加2 ml 5×載樣緩衝液。
[7]60伏電泳過夜。
[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。
[9]室温下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。
[10]室温下將膠浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min，使膠中和。
[11]20×SSC洗膠1h。
[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。
northern印跡雜交注意事項
[1]嚴格遵守試驗規則，務必準確。
[2]由於好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意自身安全，做好防護。
northern印跡雜交常見問題
①Northern雜交後繼過程的試劑能不能不用DEPC處理？不處理會不會影響結果？ 做Northern blot時，一般要求是所有的試劑都必須用DEPC處理，這是操作流程的要求，以抑制RNA酶的活性。DEPC是一種致癌劑，須小心操作，尤其在用DEPC處理乙酸銨時，因為DEPC能與銨離子反應產生氨基甲酸乙酯（一種潛在的致癌劑）。也有人認為雜交液、預雜交液、洗膜液實際上可以不用DEPC處理，但雜交液（無探針）、預雜交液、洗膜液必須要在15磅的條件下高壓30min，這樣做Northern blot也可以做出來，否則就有可能失敗。 |
②DEPC處理試劑會不會對所配置的溶液的pH值造成影響？ DEPC是極弱酸性的，由於其處理水的濃度僅有萬分之一，故用DEPC處理試劑不會導致其pH值明顯變化。 |
③以Northern雜交鑑定RNA在組織中的表達量，判斷依據是否就是最後膜條帶顯影的亮度? 一般可以認為Northern雜交是mRNA絕對定量的方法，但必須參考內參的信號，才能估算不同組織中的表達量。 |
④背景很高 背景很高的原因有多種： ·標記探針時，未摻入的dNTPs沒有完全從探針中除去。建議使用PCR產物純化柱來純化探針。 ·DNA探針的平均大小過大。最佳大小範圍為200~800核苷酸。 ·雜交溶液中探針濃度過高。對於DNA探針來説，濃度不要超過10ng/ml；對於寡聚核苷酸探針來説，不要超過50ng/ml。 ·封閉不徹底。 ·不管是在何種條件下洗滌，如果延長洗膜時間仍不能改善背景狀況的話，則要洗脱膜上的探針重新進行雜交。 |
⑤沒有雜交信號或雜交信號很弱 可能有以下原因： ·RNA降解。解決方案參見①。 ·上樣量不足。一定要保證足夠的上樣量，尤其是在檢測低丰度RNA時，總RNA通常需要50μg，溶於上樣緩衝液中。 ·電泳條件不合適。比如膠濃度太小、電泳時加樣孔偏長或電泳時間偏長，均易使較小的RNA片斷彌散，電泳0.5~1h為宜。 ·如果X線膠片曝光30~60min後仍沒有雜交信號產生，可能是雜交探針的活性很低，需重新標記探針。必要時，可採用Sephades G-50柱層析法純化標記的探針，以去除標記反應中未結合的（遊離的）核苷酸。 ·如果重新標記後探針的比活性仍然很低，則可能是標記時DNA的用量太少。DNA的用量通常為25~50ng（可根據濃的母液的OD260值計算）。如果手頭上DNA的樣品量很少，可將標記時使用的DNA量點樣在瓊脂糖凝膠上，旁邊點上已知含量的DNA標準樣品一起電泳，從中估算出探針DNA的量。經溴化乙錠染色後，如果看不到明顯的探針DNA帶，説明DNA量少於20~50ng，那麼在標記時要加大2~3倍的DNA量如果仍然失敗，則要用已知含量的對照探針（如β-actin探針）來優化標記條件。 ·還有一種可能是探針與靶基因不完全同源。如果是用種間交叉的探針進行雜交，則應降低最後洗滌條件的嚴格程度，將洗滌温度提高到50~56℃，並用洗滌液1代替洗滌液3。如果是用合成的寡聚核苷酸探針進行雜交，則應確保探針與靶基因完全同源。 |
⑥無法去除探針和再次雜交 雜交膜如果不能再次雜交，很可能是上次雜交的探針沒有完全從膜上去除，也可能是因膜已經乾燥或部分乾燥造成的。如果膜已經乾燥哪怕只是部分乾燥，要想除去膜上的探針已是不可能的了。因此，在整個洗膜過程中應避免使膜乾燥。在完成洗滌後，用鑷子將膜夾起滴去多餘的洗滌液（不要使膜乾燥），立即用塑料薄膜將膜包裹住。 |
⑦雜交2次後信號減弱 這種現象在低丰度基因中極為常見，即使是高丰度基因（如β-actin），經過2輪雜交後，雜交信號也不可能像通常看到的那樣強。 |
⑧雜交膜能否重複使用？ 結合了待測RNA的膜與探針雜交後，可經鹼或熱變性方法將探針洗脱，膜可反覆使用與其他探針雜交。方法如下：雜交的膜（注意：雜交過的膜在保存過程中不能幹燥，否則探針將會與膜形成不可逆的結合）置100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷卻至室温後，將膜放入雙蒸水中漂洗2~3遍。取出膜，用濾紙吸去膜表面的水分。將膜直接進行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好，室温下真空保存。尼龍膜可反覆使用5次以上。 |
⑨其他 |
