髮根農桿菌

土壤髮根農桿菌(Ag.rhizogenes)是一種侵染性非常廣泛的土壤細菌，能侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數單子葉植物而誘發髮根瘤。這是由其所攜帶的Ri質粒(Rootinducingplasmid)所引起的。Ri質粒上含有負責髮根瘤自主性生長和冠癭鹼合成的基因。在結構上，與Ti質粒相似，它主要具有Vir區、T-DNA區及其內的冠癭鹼合成功能區等。

髮根農桿菌Ri質粒誘發植物細胞大量繁殖，形成髮根瘤。它與根癌農桿菌Ti質粒所誘發的冠癭瘤有相似之處，也有其獨特的特徵。兩者相似於：

（1）根癌農桿菌的大質粒Ti質粒是誘發冠癭瘤所必須的，髮根農桿菌的大質粒Ri質粒是誘發髮根瘤所不可缺少的，兩種瘤都是由大質粒所引起的；

（2）髮根農桿菌所感染的植物組織細胞必須進入下一步發育途徑，即毛根的形成。另外，在一些宿主植物上，髮根農桿菌產生象瘤一樣的冠癭，而不是髮根瘤。

（3）髮根瘤組織產生農杆鹼(Agropine)，它是一種首先在章魚鹼型冠癭瘤中發現的冠癭鹼。髮根農桿菌感染植物，有時只產生無結構的瘤組織，多數情況下形成大量的毛根。毛根在離體條件下培養，能夠再生出完整的植株，這使髮根農桿菌在植物轉化方面優越於根癌農稈菌。 ^[2] 

根誘導質粒( root inducing plasmid, Ri質粒)是髮根農桿菌( Agrobacterium rhizogenes)染色體外的遺傳物質。在帶有完整T-DNA的Ri質粒的轉化植物細胞中都能檢測到一類特殊的非蛋白態的氨基酸，這一類氨基酸被總稱為冠癭鹼。在Ri質粒轉化細胞中檢測到的冠癭鹼有農杆鹼( agropine)、農杆鹼酸( agropinie acid)、農杆鹼素( agcinopine)A-D、甘露鹼( mannopine)、甘露鹼酸( mannopinic acid)、黃瓜鹼( cucumopine)。

這些冠癭鹼合成基因存在於T-DNA上，只能在真核細胞中轉錄，而不能在農桿菌中轉錄。寄主植物中合成的冠癭鹼作為唯一的碳源和氮源供農桿菌利用，而對寄主植物本身則沒有用處。某一種農桿菌類型合成一種或幾種相應類型的冠癭鹼，人們按照發根農桿菌主要合成的冠癭鹼種類來分類，可將髮根農桿菌分為3種菌株類型:農杆鹼型、甘露鹼型和黃瓜鹼型。 ^[3] 

對Ri質粒T-DNA進行改造，可以構建出新的具有目的基因和標記基因的Ri質粒，用改造型Ri質粒的髮根農桿菌感染植物細胞，可以將目的基因導入植物組織，並可再生出轉基因植物，所以髮根農桿菌為遺傳工程改良植物抗性和品質提供了一條十分有效的途徑。1985年，Ooms等用髮根農桿菌轉化甘藍型油菜的子葉，得到轉基因油菜，其皺葉等異常表型可以遺傳。同年，Arlette等用髮根農桿菌Ri質粒的T-DNA轉化胡蘿蔔，煙草，牽牛等植物葉片，從遺傳轉化的毛根再生出完整植株。Comai等用含沙門氏桿菌aroA基因的pRiA4的TL-DNA的髮根農桿菌轉化煙草，獲得耐草甘膦(Glyphosate)的轉基因植株。Robaglia等用含nptⅡ基因的中間載體的髮根農桿菌轉化煙草，獲得抗卡那黴素的轉化根與再生植株。1989年，何玉科用髮根農桿菌轉化甘藍型油菜等作物，獲得了含其T-DNA的轉化根;用髮根農桿菌LBA9402的遺傳轉化作用，從甘藍下胚軸切段誘導出含T-DNA的轉化根，並由其再生出小植株。1988年，張蔭麟用髮根農桿菌15834感染賽莨菪葉片，獲得產生生物鹼的轉化根;1992年，他又用髮根農桿菌感染金蕎麥無菌苗，誘導出髮根。1999年，王衝之等用髮根農桿菌15834感染西洋參無菌苗切段獲得髮根，PCR分析證實ro1C序列整合入轉化植株的染色體組。 ^[4] 

利用植物細胞培養技術生產次生代謝物真正實現商品化生產的還為數甚少，其主要原因在於植物細胞生長緩慢，有些還需要激素維持，次生代謝物含量太低，以及生產能力不穩定等，因而工業化生產的成本太高。髮根能合成植物特徵的次生代謝產物，而且其含量往往比植物的含量還高，尤其是它的穩定性和生長迅速的特點是工業化生產所夢寐以求的，因此髮根培養技術將成為次生代謝產物生產的一條可靠和有效途徑。國外在這方面的研究較為深入，大都從大規模生產及其生產工藝入手，國內這方面的研究起步較晚，但也取得了一些成就。

人蔘懸浮培養細胞及再生根中人蔘皂甙含量較高，但由於其生長需激素維持，因而不能作為藥品上市，Yoshikawa和Furuya通過人蔘愈傷組織誘導出髮根，在無外源激素的條件下，人蔘皂甙(Rb和Rg)含量高達乾重的0.95%，高於再生根(0.91%)和天然栽培根(0.4%)。Shimomura等誘導紫草再生植株產生的髮根在2L氣升式反應器中生長迅速，每天可回收5mg紫草色素，且可連續生產220d。天花粉蛋白是由多年生栝樓的塊根製成，近年來的研究表明天花粉蛋白能夠選擇性地抑制愛滋病病毒HIV的複製，並能抑制絨毛膜上皮癌細胞的生長，從地下挖取塊根勢必會造成資源浪費，邱德有等用髮根農桿菌R1601建立了栝樓髮根的離體培養系統，每克鮮重栝樓髮根中天花粉蛋白的含量達8.16mg;紫杉醇是從紅豆杉屬植物樹皮和針葉中分離的一種四環二萜酰胺類化合物，被稱為是過去幾十年中發現的最好的抗癌藥物，紫杉醇在植物體中的含量極低，國內外許多實驗室都在開展利用髮根生產紫杉醇的研究，由於紫杉醇的市場潛力很大，許多研究結果沒有公開發表，黃遵錫等報道了髮根農桿菌A4對短葉紅豆杉芽外植體的轉化，並檢測到髮根中紫杉醇的含量為愈傷組織的1.3-8.0倍，且髮根在懸浮培養過程中，還可向培養液中分泌0.01-0.03mg/L的紫杉醇;長春鹼的長春新鹼是存在於長春花中的具有抗癌作用的雙體吲哚生物鹼，Parr等通過誘導長春花形成髮根，從髮根中檢測到了長春鹼;Tada等用髮根農桿菌誘導芳香植物羅勒獲得的髮根培養物在無激素的培養基上生長良好並積累rosmarinicacid，而相關的酚類化合物很少;1997年，Laurain等用髮根農桿菌A4感染銀杏雌性原葉體獲得轉化胚芽，用高壓液相色譜檢測轉化胚芽的細胞培養物中銀杏苦內酯和白果內酯的濃度高達0.087%(乾重)，高於未轉化的同源細胞培養物(0.065%);Kittipongpatana等發現SolanumaviculareForst的髮根中澳洲茄胺的含量高達6.2mg/g(乾重)，高於愈傷組織(1.4mg/g)和細胞懸液(0.7mg/g);Inokova等發現不同菌株對紫雲英無菌苗誘導髮根的能力、髮根生長速度、皂苷的產量均有影響，轉化根在沒有硝酸銨和植物激素的MS培養基上生長良好，培養基中加入谷固醇後，皂苷產量有明顯增加;Tana-ka等用髮根農桿菌感染風鈴草獲得轉化根，發現轉化根中產生3-葡萄苷花青素、3-芸香苷花青素及黃酮類化合物等，同時還發現光照和BA有助於花青素的積累;Yu和Kanokwaree等還研究了氧氣對顛茄髮根生長的影響。劉春朝和劉本葉等對青蒿髮根青蒿素的培養條件和生物合成動態進行了研究;鄭志和等對黃芪髮根的大量培養和髮根中化學成分及免疫功能活性進行了研究。這些實驗表明，親本植株能合成的次生代謝物可用髮根培養物來生產，因而被認為是一條利用生物技術生產次生代謝物(如藥物、天然色素、香料、天然調味品等)的新的有效途徑，可以説這一技術的出現是次生代謝物研究領域中的一次重大事件。 ^[4] 

Ri質粒能誘導轉化植物產生大量毛根，促進植物生根，已引起了人們的高度重視，被人們廣泛使用。1985年它被應用於蘋果與扁桃的插條以改善生根狀況，從而有益於對乾旱的抵抗。Hatta等發現髮根農桿菌能誘導棗樹的插條生根，Caboni等用野生髮根農桿菌1855感染胡桃的微小切口，誘導出髮根;Rinallo等發現髮根農桿菌的T-DNA能促進榆樹生根。Ri質粒的這一特性對於難生根植物生根、存活具有重要意義。 ^[4] 

另外，還可以用Ri質粒作為載體通過髮根農桿菌向植物基因插入外源基因生產外源基因產品，Stougaaard等用含大豆血紅蛋白基因的農杆鹼型質粒pRi15834(中間載體)誘發牛角花產生毛根，並由毛根獲得基因表達的再生植株。髮根培養技術的發展歷史雖然較短，但Ri質粒作為植物基因工程載體已顯示出其可行性與方便性，隨着研究的深入，它將會成為比Ti質粒更理想的基因轉移系統，更多的次生代謝物將會通過髮根培養系統來生產，並被用於難以插活植物的生根和生產外源基因產品。 ^[4]