雙分子熒光互補

雙分子熒光互補技術本質上是一種蛋白質片段互補技術，是指將熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開，形成不發熒光的 N-和 C-末端2 個多肽片段。將這 2 個熒光蛋白片段分別連接到 1 對能發生相互作用的目標蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這 2 個融合蛋白時，由於目標蛋白質的相互作用，熒光蛋白的 2 個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，從而產生熒光 ^[2]  。

可視化是 BiFC 技術最大的特點。在此技術中，熒光蛋白由於相互靠近而重新構成能發出熒光的蛋白，這種熒光是自我催化的結果，不需要底物與輔助因子，非常穩定，而且通過熒光顯微鏡和流式細胞儀等常規儀器很容易檢測到BiFC 信號，這種直觀性使得 BiFC 技術在短短几年迅速獲得應用，已經成為檢測活體細胞中蛋白質相互作用的一種常規方法。這種可視性既可以直觀地觀察到蛋白的相互作用，而且還能通過對這種可視化的熒光進行定量從而確定蛋白相互作用的強弱，極大地方便了蛋白相互作用之間的研究 ^[2]  。

熒光蛋白結構穩定，能在非厭氧條件下的幾乎所有細胞中表達，這種穩定性極大地拓寬了熒光蛋白的應用範圍。迄今為止，各種 BiFC 系統已經被成功用於不同宿主細胞中，包括動物，植物、真菌和細菌中；除了體內，BiFC技術還能應用於體外試驗中 ^[2]  。

在眾多的蛋白片段互補技術中，雙分子熒光互補技術中可選擇的互補蛋白片段更多，主要體現在如下 3 方面。

①熒光蛋白自身種類多，綠色熒光蛋白通過突變，可以形成激發波長不一樣的熒光蛋白，如 YFP，BFP，CFP 和 RFP等 ^[2]  。

②同一種熒光蛋白可以在不同位置剪切成能進行功能互補的熒光片段 ^[2]  。

③不同的熒光片段之間可以進行功能互補。互補的熒光片段種類多，使得通過熒光互補技術在同一細胞中觀察多個蛋白的相互作用成為可能 ^[2]  。

BiFC 技術的最大缺陷是多個 BiFC 系統對温度敏感。温度高時，片段間不易互補形成完整的熒光蛋白。一般在30 ℃以下形成互補效應好，温度越低，越有利於片段之間的互補，這就對研究細胞在生理條件下的蛋白質相互作用帶來不利因素 ^[2]  。

這種特點使得通過 BiFC 技術來研究蛋白相互作用的動態變化成為可能 ^[2]  。

實驗中，一些陰性對照的信號在檢測蛋白與蛋白相互作用中較高，這將造成假陽性結果。可能的原因是最初分開的 2 個無熒光的片段具有內在的親和力，導致無特定相互作用的自發組裝。由於這個侷限，BiFC 的高靈敏度、時空分辨率和準確性受到質疑。研究表明通過定點缺失和定點突變改變蛋白相互作用可有效減少假陽性結果的出現 ^[2]  。

這是 BiFC 的一個主要應用，通過 BiFC，已經很直觀地觀察到了多個蛋白之間存在相互作用 ^[2]  。

不同的蛋白位於細胞的不同位置，為了研究蛋白的功能與結構，首先要了解它們之間的相互作用。BiFC 技術能確定蛋白相互作用的準確位置。並且能夠檢測相互作用的蛋白穩定性。BiFC 不僅能觀測到細胞內較強相互作用，也能檢測到比較弱的相互作用 ^[2]  。

BiFC 系統還被用於蛋白質構象研究。Lim 等人利用雙分子熒光互補技術，研究分析了 Wiskott-Aldrich 綜合症相關蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP) 的構象變化。他們將 YFP 的兩個片段與 WASP 構建成了一個融合基因形式:YFP1-154-WASP-YFP155-238。將這個融合基因導入釀酒酵母，在細胞核中能檢測到強烈的熒光。而共表達 YFP1-154-WASP 和 WASP-YFP155-238 的酵母卻檢測不到熒光。這就表明，WASP 存在分子內的相互作用，進一步的試驗表明，WASP 在細胞中是一種自我封閉的構象存在 ^[2]  。

BiFC 對細胞內的 RNA 可進行特異性標記 ^[2]  。

在 BiFC 實驗中影響因素有很多，除了宿主細胞和熒光蛋白的種類外，還有形成融合蛋白時插入到熒光蛋白片段上的小肽和熒光蛋白的位置 ^[2]  。

1.Linker 的序列

通常在熒光蛋白質片段與目標蛋白質之間加 1 個連接肽，防止由於蛋白質空間位阻導致蛋白片段間不能相互靠近現象出現。常用的連接肽氨基酸序列有RSIAT、RPACK-IPNDLKQKVMNH和GGGGS等。linker 為單鏈結構，因此存在空間位置上的旋轉靈活性，這使熒光蛋白片段更容易相互靠近發生相互作用，重新產生熒光 ^[2]  。

2.熒光蛋白片段的位置

在 BiFC 試驗中，熒光蛋白片段的位置對結果的影響是顯著的 ^[2]  。