鍵合相色譜法

1.正相色譜法

在正常相色譜法中共價結合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由於固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脱能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關係正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。儘管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據化合物在固定相及流動相中分配係數的不同進行分離，它不適於分離幾何異構體。

2.反相色譜法

在反相色譜法中共價結合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等。流動相的極性比固定相的極性強。反相色譜法在高效液相色譜法中應用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質時，溶質分子之間的相互作用 、溶質分子與水分子之間的相互作用遠小於水分子之間的相互作用， 因此溶質分子從水中被“擠”了出去。可見反相色譜中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適於分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物。此外，反相色譜法可用於分離帶有不同極性基團的化合物。可以通過改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中佔的比例伸縮性很大，可以/從0-100%，從而使反相色譜可用於水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨着碳氫鏈的長度而增加，在反相色譜柱中溶質由於疏水作用而滯留的時間也將隨着碳氫鏈的長度而增加。在一般情況下這意味着用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數情況下是依靠反覆來選擇色譜柱。由於反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物，溶質與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者説疏水相互作用，因此溶劑的強度隨着極性降低而增加。水是極性最強的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環也常被用作修飾劑。

在生化分析中，反相色譜的應用極廣。

可用於

①氨基酸和多肽的分析；

②蛋白質的分離；

③鹼基，核酸和核酸酶的分析；

④甾體化合物的分析；

⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。

非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；

用於反相色譜；

長鏈烷基可使溶質的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩定性更好。

醚基和二羥基等鍵合相；

用於反相或正相色譜。

常用氨基﹑氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN）鍵合硅膠；

一般用於正相色譜 。