反相色譜法

“反相”這個詞有着其歷史背景。在1970年代，大多數液相色譜是在未修飾的氧化硅或氧化鋁上完成的，他們表面的化學性質是親水性的，對於極性化合物具有更強的親和力，因此也叫做“正相”（正常）色譜。若採用烷基鏈共價鍵合到支持表面上，則會倒換洗脱順序。在反相色譜法中，極性化合物先被洗脱出來，而非極性化合物被保持住，因為它們親和於反相表面。在其他色譜方法中所使用的所有數學與試驗研究在反相色譜中亦適用（例如色譜分辨率與柱長成正比）。反相柱色譜法在分析型液相色譜中佔絕大多數比例。

在普通氣相色譜中，固定相是巳知的，被測的樣品在流動相里。由載氣帶入色譜柱進行分離。反相色譜法(IGC)卻一反普通氣相色譜的測定方式。以被測的高分子為固定相、以惰性氣體為流動相，為了測定需要，在流動相中加入一些探針分子，它們是揮發性的低分子。將探針分子注入氣化室氣化後，由載氣帶入色譜柱，測定它們在兩相中的分配，從而研究高分產的各種性質，高分子與探針分子的相互作用以及高分子與高分子間的相互作用。 ^[1] 

在反相色譜法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基、這也是使用得最多的固定相、流動相的極性比固定相的極性強。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出、極性小的組分後流出。一般説來，固定相上的烷基配合基或被分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數越大，則締合作用越強，保留值越大。 ^[1] 

對於生物高分子(例如生物工程產物)的反相色譜分離、特別是對多肽藥物的分離純化，需要儘可能高的分離效率，因此儘可能地選擇球形、全多孔，且孔徑為25um以上的硅胺鍵合固定相。單層鍵合固定相利於傳質但穩定性稍差，而多層板合固定相傳質雖稍差但穩定性好。對分子量較小者，可選用ODS型配基，而分子量較大者以配基較短者為宜，但鏈短者穩定性比鏈長者稍遜。結合無機和有機基質優點的聚合物塗層型固定相有着更廣泛耐用的pH直範圍，這對生物大分子的分離是極其有利的因素。不過聚合物塗層型無論從製造還是從使用方面尚不如鍵合相成熟。 ^[2] 

作為反相色譜流動相的自機溶劑主要是乙腈、異丙醇四氫呋喃等，乙腈由於黏度低，且和水組成的二元流動相對多肽和蛋白質的溶解度高，因此被廣泛應用，在醇類溶劑中，由於甲醇對一些蛋白質的溶解度低，因而使應用受到了限制，乙醇、正丙醇、特別是異丙醇，和水組成的洗脱體系一般可以得到高的蛋白質回收率而被廣泛採用。在選擇有機溶劑的同時，要充分考慮到反相柱的類型和生物大分子的特性。 ^[2] 

1、溶質的分子結構（極性）

極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。同系物碳數越多，極性越弱，k越大；引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。

2、固定相

鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質的k越大。

3、流動相

極性越強，洗脱能力越弱，使溶質的k越大；溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑；溶劑比例：水的比例增加，使k增大。 ^[2] 

近十年來，高效液相色譜在蛋白質分離純化方面取得了很大的進展，並得到了廣泛的應用。HPLC包括排阻色譜、離子交換色譜、親和色譜以及反相色譜等，幾乎已在蛋白質分離中得到應用。這些方法在蛋白質分離中各有其地位，但到目前為止人們普遍認為反相高效液相色譜是分離純化蛋白質的最有效的方法之一。 ^[2]