蜂毒肽

人類社會利用蜂毒的歷史悠久，同時人們對蜂毒和蜂毒肽的研究也在不斷深入。自從1952年Neuman等人用電泳法分離獲得蜂毒肽以來，關於蜂毒肽的研究拉開了帷幕，很多研究發現蜂毒肽對體內外多種腫瘤細胞都有殺傷作用。 ^[7] 

1972年，Habermant報道1μmol/L的蜂毒肽就能阻止腫瘤細胞增殖但卻不抑制正常細胞的生長與克隆率。 ^[7] 

1983年，Vlasak等用mRNA-DNA逆轉錄的方法，利用質粒pBR322構建了蜂王毒腺的cDNA文庫，用蜂王毒腺總mRNA製作探針從此文庫中分離得到了蜂毒肽的cDNA，再進一步將其克隆到質粒pUC18上進行DNA序列分析，由DNA的序列分析結果推測出的蜂毒肽序列與實際測得的完全相同。 ^[8] 

1996年，Arora通過對正常大鼠肝細胞與大鼠肝癌細胞抗缺氧損傷能力的實驗對比，證實蜂毒肽激活磷脂酶A2（PLA2）能夠解除肝癌細胞對缺氧的抵抗。DUnn等將來自於鼠抗人骨髓瘤細胞和淋巴瘤細胞表面特異蛋白的抗體SCFV基因同蜂毒肽基因相融合，構建了能殺腫瘤細胞的抗毒素基因，大腸桿菌中融合基因並表達，精製的抗毒素顯示了體外殺死腫瘤細胞的效能。 ^[7]  Kindas等從處女蜂王的毒腺中提取得到了總mRNA，發現蜂毒肽mRNA含大約400個鹼基對和1個短的polyA尾。 ^[9]  Haase實驗表明蜂毒肽可以激活細胞脂酶，包括磷脂酶C（PLC）、磷脂酶D（PLD）、磷脂酶A2（PLA2）及甘油三酯酶等。 ^[10] 

1991年，張青文開始提取了蜂王毒腺的RNA，用於棉鈴蟲卵中的轉譯，成功地合成了Promelittin，並對提取的mRNA成分進行了研究，結果發現總RNA在除去rRNA後就可得到高純度的蜂毒肽mRNA。 ^[11] 

1997年，李繼周等通過mRNA-cDNA反轉錄的方法合成了蜂毒肽基因，用λgt11建立了蜂毒肽的cDNA文庫，並用抗體探針篩選出能夠表達蜂毒溶血肽的陽性克隆。 ^[12]  Benachir等利用鈣黃綠素作為熒光標記物，系統研究了蜂毒肽誘導的膜滲漏。認為蜂毒肽與囊泡的結合會非常迅速，而且在蜂毒肽作用下，有的囊泡的內容物全部釋放，而有的則保持完整。內容物釋放的比例與蜂毒肽/脂質的摩爾比率有關。更為特別的是蜂毒肽可以區別出完整的和已經有物質滲出的囊泡，而且表明卵磷脂雙分子層表面負電荷的存在對蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，並且與負電荷的密度成一定比例。 ^[13] 

1999年，Kubo等通過5種細胞毒的測定方法對蜂毒肽與嗜酸性粒細胞的主要鹼性蛋白進行比較，結果證實蜂毒肽能插入K562細胞的胞膜中進而形成孔道，引起Ca²⁺內流，使胞內Ca²⁺濃度升高，細胞裂解。1小時內，蜂毒肽對實驗的白血病細胞均具殺傷效果。Shamsher等研究發現蜂毒肽可激活磷酸脂酶D進而裂解人單核白血病細胞（U937）。 ^[3] 

2000年，王關林等從蜜蜂毒腺中提取總RNA，通過RT-PCR方法擴增得到了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，再進一步通過定點誘變在蜂毒肽序列前引入了經胺裂解位點，構建了與β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽誘變蛋白表達載體，序列分析結果表明，他們成功地引入了目的密碼子，且與β-半乳糖苷酶部分序列構成正確的讀碼框，並在大腸桿菌中表達了誘變蛋白。 ^[14] 

2001年，黃雪強等通過人白血病細胞觀察蜂毒肽促凋亡的作用，結果發現對白血病細胞5mg/mL蜂毒肽作用4h與4μg/mL蜂毒肽作用24h都可見典型凋亡特徵，進一步實驗發現其誘導細胞凋亡同bcl-2基因表達顯著下降相關。 ^[3]  王秋波等通過人工合成含特異性酶切位點的AB兩條寡核苦酸片段，在Klenow酶作用下形成目的基因，用限制型內切酶HindⅢ，XmnⅠ同時酶切目的基因和表達載體Pmal-p2質粒，在T4連接酶的作用下構建兩者的重組體，通過α-互補篩選出附性克隆，並通過特異性酶切和測序分析進行鑑定，獲得重組蜂毒肽的原核表達克隆。 ^[15] 

2003年，劉嶺等通過MTT法對SMMC-7721、BEL-7402和Hep-3B三種肝癌細胞系進行研究，考察蜂毒肽抑制腫瘤的量效關係，結果顯示：在8～64μg/mL劑量時，蜂毒肽的抑瘤率直線上升，在體外表現顯著的抗瘤效果。據此推測，可能與在高濃度中蜂毒肽的自聚集相關，高濃度下多呈四聚體的狀態，與單體相比更能與細胞膜有效地結合，進而形成離子通道，改變胞膜通透性，裂解胞膜，表現出極強的體外殺傷腫瘤的效果。 ^[3] 

2004年，李柏、張晨等應用基因工程研究證明，蜂毒素具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。經攜蜂毒素基因重組腺病毒轉染後，倒置相差顯微鏡下觀察到部分肝癌細胞出現凋亡形態學變化，體積變小、變圓，染色質邊集等現象。攜蜂毒素基因重組腺病毒可有效誘導肝癌細胞凋亡，凋亡率在20%左右，高於不含基因重組腺病毒和未轉染重組腺病毒對照組，提示誘導腫瘤細胞凋亡亦是蜂毒素基因治療發揮作用的機制之一。 ^[16] 

2005年，趙亞華等通過實驗有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一級結構序列以及所要表達的蜂毒素基因。儘量使蜂毒素在與細菌細腦膜相互作用時，主要採取地毯模式侵膜而引起殺菌，同時，由於帶電荷數與分子構象的改變，大大降低了它與血細胞膜兩親性作用的幾率，從而達到抑制溶血性的目的。改造後的蜂毒素的溶血性與標準樣品的溶血活性相比，有較大幅度降低，大約降低了14.3倍。 ^[17] 

2009年8月11日英國《每日郵報》報道，美國華盛頓大學的科學家公佈一項研究成果——他們藉助納米技術，開發出一種在顯微鏡下才能看到的“納米蜜蜂”。“小蜜蜂”能鑽進癌細胞，釋放蜂毒肽，將癌細胞一個個消滅掉。“小蜜蜂”內部還有專門的定位物質，能夠指引它一路前行，直達患處。在實驗中，“納米蜜蜂”已經令患有乳腺癌的小白鼠體內的癌細胞減少了45%，而患有皮膚癌的小白鼠體內的癌細胞則鋭減了75%之多。 ^[18] 

蜂毒肽是由26個氨基酸殘基組成的多肽，其一級結構的氨基酸殘基順序為Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH₂ ^[6] 

在通常情況下，C-末端有4個氨基酸殘基攜帶正電荷，N-末端有2個氨基酸殘基攜帶正電荷，整個分子帶6個正電荷。蜂毒肽的N-末端起前20個氨基酸殘基主要是疏水的，C-末端的6個氨基酸殘基主要是親水的。

分子的3個賴氨酸和2個精氨酸殘基使其成為強鹼性肽，在中性水溶液中，蜂毒肽作為單體是以隨機的捲曲結構存在的，而隨着pH值以及離子強度的增高，蜂毒肽自我交聯，形成螺旋的四聚體結構，有研究發現在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋結構區域及螺旋間的角度是不同的。螺旋結構中前21個氨基酸是極性的，位於螺旋的表面，而非極性氨基酸在螺旋的另一面。其兩親性（am-phiphilie）是膜結合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特徵。所以這個特性決定蜂毒肽既可以溶於水中，又可以與膜自然結合，進而溶解細胞。 ^[5] 

明蜂毒肽對超氧陰離子和羥自由基均有很好的清除作用。蜂毒肽對超氧陰離子具有一定的清除作用，呈現明顯的量效關係。蜂毒肽對於·OH的清除作用效果明顯。 ^[19] 

目前獲取蜂毒肽的方法有3種，化學合成、從粗蜂毒中分離純化和生物工程法。利用化學合成的方法可以獲得具有生物活性的蜂毒肽純品，但其成本太高，並不適合蜂毒肽的生產，實際應用較少。目前，獲取蜂毒肽純品的主要途徑是從粗蜂毒中分離純化。分離純化方法以色譜理論為基礎，隨着色譜技術的發展以及與其他提取工藝的結合，操作成本逐漸降低，產量和純度有所提高。利用生物工程技術可以誘導蜂毒肽基因在工程菌中表達，然後收集純化表達蛋白，從而得到蜂毒肽純品。由於蜂毒肽有破壞細胞膜以及致死細胞毒性，其在工程菌中的直接表達無法實現。面對這個問題，科學家們找到了在工程菌中表達蜂毒肽融合蛋白的方法，並在融合蛋白的選擇及後期分離純化上進行了大量研究，取得較大進展。 ^[20] 

蜂毒肽具有多種生物學、藥理學和毒理學作用，包括對細胞膜的強表面活性作用、溶血、抗菌以及潛在的抗腫瘤作用。蜂毒肽可以穿過磷脂雙分子層形成孔洞，利用這種生物活性可以研究生物膜與蛋白質之間的相互作用。在發現蜂毒素對磷脂酶A2（PLA2）活性的增強作用後，蜂毒素也被用作磷脂酶A2（PLA2）的活化劑。蜂毒肽還是一種獨特的致痛物質，它影響着軀體感覺系統的神經元可塑性。 ^[6] 

蜂毒肽是迄今為止人類所知的抗炎活性最強的物質之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽性細菌的生長繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗對青黴素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒肽還能增強磺胺類和青黴素類藥物的抗菌效力，對多種真菌、病毒也具有毒性。它具有類激素樣的作用，但無激素的不良反應。蜂毒肽的鎮痛作用也十分顯著，其對前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚鎂辛的70倍，鎮痛強度為嗎啡的40%，鎮痛持續時間較長。實驗研究證明，全蜂毒、蜂毒肽、神經毒多肽、MCD均能刺激垂體腎上腺系統使皮質激素釋放增加而產生抗炎作用。蜂毒肽還能抑制白細胞轉移，從而抑制了局部的炎症反應。 ^[5]  可直接抑制炎症、腫脹；刺激垂體一腎上腺系統，促進皮質激素的釋放，抗炎調整免疫功能，還可直接升高血漿皮質醇；抑制白細胞移行，限制炎症的局部反應。可用於治療膠原組織疾病、免疫系統疾病。 ^[1] 

蜂毒對神經系統具有抑制作用：①抑制中樞神經系統，表現為膽鹼對神經的阻滯，造成半球皮層和皮質下（特別是下丘腦）的廣泛抑制；②抑制植物神經系統交感神經節的興奮傳導，使胃腸平滑肌活動和興奮性增強；抑制周圍神經衝動的傳導，阻礙或延遲其傳導速度。 ^[1] 

用蜂毒肽代替蜂毒全毒不僅對輻射有預防作用，而且還有治療作用。高純度的蜂毒肽可以明顯提高抗輻射效應，而且和全蜂毒比較差別非常明顯。蜂毒肽對腫瘤細胞的毒性作用也引起了人們的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接對細胞的磷脂膜起溶解作用，抑制細胞發育，對腫瘤細胞有強烈的細胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易產生過敏反應；因其是破壞細胞膜而導致細胞的死亡，因此它不用進入細胞，在細胞外即可顯示出其破壞腫瘤細胞毒性。澳大利亞聯邦科學與工業研究組織（CSIRo）DERiven博士領導的分子生物學研究小組製造的以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素也可對前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌產生療效。蜂毒素可抑制肝癌細胞的生長、增殖，並且減少增殖細胞中和抗原附性細胞的表達，影響細胞週期的比率。 ^[5] 

抗凝、纖溶作用：通過抑制凝血活酶和凝血酶原激活物生成，以及抑制血小板的聚集，可以消除血栓形成前的狀態，臨牀可用於動脈粥樣硬化和血栓形成的防治。蜂毒肽通過破壞紅細胞膜的通透性，具有直接溶血作用。 ^[1] 

降壓、抗心律失常，改善腦血流及心肌功能作用：蜂毒肽可破壞肥大細胞和亞細胞結構而釋放組胺入血液，降低外周阻力而降壓，同時其釋放的活性化合物作用於腦血管，通過擴張腦血管增加腦血流量，因此特別適用於高血壓病患者導致的腦循環障礙；並且還增加冠脈血流速，改善心肌供血，提高心臟功能，具有強刺激垂體一腎上腺系統的作用，使血漿皮質醇與尿17-酮固醇含量增加，表現為較強的抗心律失常的作用；並且還有降低膽固醇作用。 ^[1] 

2013年3月，美國科學家發現可以利用在蜂刺毒素中發現的化學物質毀滅艾滋病毒，防止艾滋病傳播，但又不傷及周圍正常細胞。蜂刺中的化學物質蜂毒肽可以刺穿艾滋病毒的保護外層，毀滅艾滋病毒。科學家們把這種毒素注入納米粒中，上面配有特製的“緩衝器”，使之能夠彈離正常細胞，從而避免傷及正常細胞。當較小的艾滋病毒與它們接觸時，會從緩衝器之間滑過，遭到毒素攻擊。此前，大多數藥物只能減緩艾滋病毒的生長，而最新研究出的這種蜂毒能夠攻擊並殺死病毒，第一時間防止感染。醫生們還認為，可以進一步開發納米粒子，嘗試殺死腫瘤細胞。 ^[21] 

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