腸激酶

由於經EK裂解融蛋白所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列, 因而可作為蛋白表達體系中融合蛋白的切割試劑。但是天然的腸激酶來源畢竟有限, 並且提取分離的成本高, 加之天然提取的腸激酶易為其它蛋白酶污染, 造成切割融合蛋白的同時又降解了目的產物。而基因工程的方法正可以彌補這些不足, 因而運用基因工程的方法生產腸激酶廣為應用。商品化的腸激酶主要有兩種:天然提純的牛腸激酶和基因工程重組牛腸激酶。

天然腸激酶由1條結構亞基 (重鏈) 和1條催化弧基 (輕鏈) 構成, 兩者通過1個分子間二硫鍵結合, 結構亞基負責將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上並引導它向腸腔移動, 催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列並沿序列的羧基端切下, 將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶, 從而啓動各種酶原活化的級聯。

重組腸激酶 (recombinant Enterokinase, rEK) 的分子質量通常為26.3ku, 具有3個糖基化位點, 其糖基化分子質量大約為43ku。Vozza等發現, rEK體外實驗證明有全酶酶切特異性並且相較於天然腸激酶表現出對基因工程融合蛋白底物的酶切活性增強, 因而現多采用基因工程的方法生產腸激酶。近年來所做的嘗試多是克隆與表達235個氨基酸的輕鏈 (recombinant Enterokinase light chain, rEKL) 。 Janska等研究氨基末端殘基發現了EK輕鏈的三維結構與類胰蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶的結構同源性。Seong等則發現將輕鏈氨基末端的Ile突變為Val其酶活JL乎不發生改變。另外, 有研究發現EK的重鏈強烈影響腸激酶對大分子底物的識別而對合成的融合蛋白或小分子底物的識別沒有影響。

腸激酶在體內激活胰蛋白酶原轉化為胰蛋白酶, 由於腸激酶的輕鏈結構在人、牛和豬中保守, 其識別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強的保守性, 且幾乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有4個天冬醯胺相連的特徵, 此序列在其他的天然蛋白質上又非常罕見, 而腸激酶的活性中心有1個特殊的陽離子位點, 使得有強大負電的Asp-Asp-Asp-Asp可以與此陽離子位點結合, 因此, 牛腸激酶的底物酶切位點序列具有高度的特異性, 這種特點使得EK成為基因工程融合蛋白表達後修飾過程中1個極其有用的工具而被廣泛應用。對於EK酶切的高度特異性, Rumsh[8]認為是由於酶中鈣離子的喪失使得酶自切割, 從而具備了激活其它酶的高度特異性。但是在實際的酶切反應中也可能產生一些非特異性的切割[3], 在基因工程研究中應認真對待此問題。

與大多蛋白的分離純化方法類似, rEK可通過硫酸銨沉澱、DEAE柱、凝膠層析和透析等方法得到純品, 另外, 運用組氨酸 (Histidine, His) 在蛋白末端進行標記, Nickel金屬螯合柱親和純化這種低成本高效率一步分離蛋白的方法, 也正廣泛地運用到rEK的分離純化, 其收率可達50%以上。對於His-tag的位點, Choi等研究發現rEKL的C末端進行His標記, 用Nickel金屬螯合柱親和純化後其酶活不發生改變, 而在N末端進行His標記後通過Nickel金屬螯合柱則酶活喪失。

1.4 生理特點

1939年Kunitz證實腸激酶是胰蛋白酶原的生理激活劑, 而胰蛋白酶是消化系統其它許多酶原的激活劑, 因此腸激酶被認為是消化系統重要的起始酶之一。一般認為EK存在於小腸刷狀源細胞膜上, Zamolodchikova等認為pro-EK是由十二指腸酶激活的。病理研究發現, 十二指腸與胰腺的迴流液中富集EK會激活過多的胰蛋白酶原從而導致急性胰腺炎, 而EK缺陷的機體將會有腹瀉、嘔吐、浮腫等症狀, 造成發育不良, 導致血蛋白不足症和貧血。 ^[1]