胎血

研究VEGF,bFGF誘導下人臍血單個核細胞向血管內皮祖細胞(EPCS)分化

從新鮮臍血中用Ficoll密度梯度離心法獲取單個核細胞，在加有VEGF，bFGF的M199培養基中培養，培養7d，免疫組化(SABC法)和免疫熒光檢測細胞表面抗原的表達.

人臍血血單個核細胞(MNCS)經體外VEGF,bFGF的誘導分化，表達內皮祖細胞的表面標誌KDR,CD1133和CD34.

人臍血單個核細胞在一定的培養條件下可誘導分化為內皮祖細胞.

內皮祖細胞(endothelialprogenitorcells, endothelialprogenitorcells EPCs)是一類能增殖並分化為血管內皮細胞,但尚未表達成熟血管內皮細胞表型,也未形成血管的前體細胞[1].研究發現,EPC不僅參與人胚胎血管生成,同時也參與出生後血管新生和內皮損傷後的修復過程,因此,EPCs在冠心病、腫瘤、創傷癒合等疾病具有廣闊的臨牀應用前景.今年來，EPCs在基礎研究、心血管疾病、肢體缺血性疾病等領域的研究十分活躍，國外關於EPCs的研究初步深入，而在國內EPCs的研究尚處於起步階段.我們從人臍血中分離培養、體外擴增並觀察EPCs的體外分化過程，為EPCs的進一步研究打下基礎.

1材料和方法

1.1材料比重1.077±0.001的聚蔗糖泛影葡胺（商品名為淋巴細胞分離液）.DHanks液（無Ca2+,Mg2+）.VEGF,bFGF為Sigma公司.胎牛血清（杭州四季青公司）.鼠抗人CD34單克隆抗體，兔抗人KDR單克隆抗體，FITC標記羊抗鼠、羊抗兔二抗，鼠抗人CD133單克隆抗體(SantaCruz公司).M199培養液，免疫組化染色試劑盒（即用型SABC）（武漢博士德生物工程公司）.美國SantaCruzBio公司熒光顯微鏡；OlympusCK40型倒置顯微鏡；低温高速離心機Biofuge22R型.

1.2方法

1.2.1EPCs的採集和分離人臍帶血均取自足月健康的產婦，每份採血約40~60mL，複方枸櫞酸鈉注射液（acda）按1∶10加入抗凝.然後1∶1加入PBS稀釋，EPCs的分離採用Ficoll密度梯度離心法.2000r/min,20min離心後管內分為三層，取上、中層界面處以單個核細胞為主的白色雲霧層狹窄帶置入另一離心管中，以Hanks液離心洗滌細胞兩次.末次離心後，棄上清，以M199培養液（含有100mL/L胎牛血清，細胞生長因子VEGF和bFGF）重懸細胞.取一滴細胞懸液與一滴2g/L台酚蘭染色液混合，計算單個核細胞的濃度及細胞活力的檢測.

1.2.2EPCs的培養單個核細胞以5×108/L的密度接種於鋪有10g/L明膠的培養瓶中，放入37℃,50mL/LCO2，濕度100%的細胞培養箱培養，48h後棄去貼壁細胞，懸浮細胞離心後用M199培養液重懸，以2×108/L的密度接種於放有蓋玻片的六孔板中.每3d換液，用Hanks液洗掉未貼附的細胞.在培養的第7日收集爬片細胞,進行鑑定.

1.2.3免疫熒光檢測取培養第7日的爬片細胞，40g/L多聚甲醛固定20min，再用PBS洗3次，每次5min，乾燥後加入FITC直標鼠抗人CD133單克隆抗體100μL(1∶50倍稀釋)，放入濕盒內37℃保温1h，同時以PBS替代CD133單抗作陰性對照.然後用PBS洗2次，蒸餾水洗一次，封片，熒光顯微鏡下觀察.

1.2.4免疫組織化學檢測爬片細胞在培養第7天用40g/L多聚甲醛固定20min,內源性過氧化物酶用30ml/LH2O2滅活,非特異性結合用30ml/LBSA阻斷,抗體為兔抗人KDR、鼠抗人CD34.4℃過夜,SABC法顯色,蘇木素復染,脱水、封片，倒置顯微鏡下觀察結果.

2結果

從新鮮臍血中得到的單個核細胞呈圓形，苔盼藍染色顯示細胞存活率為99%.被分離的臍血單個核細胞在培養48h後出現貼壁，在4～5d時生長最快，大約在培養5d出現大量的梭形細胞.單個核細胞培養5d後，鏡下可見大量的細胞團形成.大約在培養6d，可見長梭形細胞以細胞團為中心呈放射狀生長.同時，也可見散在的長梭形細胞.培養7d，可見由多個長梭形細胞首尾相連形成條帶樣排列，有時還可見到兩排細胞平行排列呈管樣結構（圖1）.進行KDR,CD133和CD34等表面標記物的免疫熒光及免疫組化檢測，免疫組化顯示CD34,KDR呈陽性染色.免疫熒光顯示細胞CD133陽性染色，熒光顯微鏡下細胞膜和胞漿中可見黃綠色熒光（圖2）.

A：細胞團（5d）；B：長梭形細胞形成條帶樣（7d）×200.

圖1外周單個核細胞培養圖2免疫熒光檢測CD133陽性染色（7d）×400（略）

3討論

Ashara等[3]1997年從外周血中分離培養出EPCs，並且證明EPCs也參與了出生後的血管生成.這一發現為缺血性疾病提供了一種全新的治療方案，可以通過動員、體外擴增、移植EPCs來促進新生血管的形成.本實驗擬在建立一種較為簡便可靠的方法來獲取EPCs，為EPCs的臨牀應用做準備.

目前體外分離EPCs的方法有多種，主要有密度梯度離心法和免疫磁珠分選法.也有部分學者將2種方法結合起來，先離心後再用免疫磁珠分離分選.密度梯度離心法操作簡便、使用方便，但存在分離不純，只能將血中整個單核細胞（包括EPCs）分離出來，還包括部分的血小板.而免疫磁珠分選法一般早期採用CD34抗體，近年越來越多的學者採用CD133抗體，此方法最大的優點是可以收集到較高純度的EPCs，但許多學者發現，分離的CD34+或CD133+細胞數非常少，單獨培養時往往不增殖，只能在和CD34-或成熟內皮細胞共同培養時才有增殖活性[2].而且免疫磁珠分選法存在操作複雜和費用較高的缺點，故難以推廣.CD34被一些研究者作為分離內皮祖細胞的特異性標記[4].CD34在早期造血幹細胞中高表達，隨造血細胞成熟表達下降，但它在血管內皮細胞中也表達.因而用CD34分離的循環內皮細胞難以區分是血管壁脱落的成熟內皮細胞，還是內皮祖細胞.近年來報道CD133是一種五次跨膜細胞表面分子(Mr120000)，是一種早期抗原，它選擇性地在骨髓和外周血造血幹細胞及內皮祖細胞表達[5]，但在成熟內皮細胞上不表達[4].因此，採用CD133分選可排除血管壁脱落的成熟內皮細胞.

胚胎髮育過程中，各器官組織中均存有血管內皮細胞，隨着各器官功能分化，血管內皮細胞發育為器官特異性內皮細胞，但內皮細胞亦具有共同的抗原.為了確定貼壁梭形細胞是內皮細胞，我們採用內皮細胞特異性標誌KDR,CD133,CD34來鑑定.結果發現，貼壁的梭形細胞不同程度地表達這些特異性標誌，這説明培養出的梭形細胞為內皮細胞.

臍血作為一種幹細胞資源，具有取材無創傷，資源豐富，富含早期幹細胞等諸多優點.臍血中造血幹祖細胞的數目要明顯高於同等量的外周血，作為造血幹細胞的來源之一，有人估計骨髓、臍血、成人外周血中CD34+細胞比為3∶2∶0.2.我們從臍血中分離CD133細胞成功誘導分化成內皮細胞，提示臍血中存在內皮祖細胞，它可以作為產生內皮細胞的來源但是，每份臍血所含內皮祖細胞有限，因此，為了滿足治療性血管重建要求，需進一步探索適宜的生長因子組合及時間條件，使其能穩定的進行體外擴增，從而使內皮祖細胞治療缺血性疾病更接近臨牀.