綠熒光蛋白

由水母Aequoreavictoria中發現的野生型綠熒光蛋白，395nm和475nm分別是最大和次大的激發波長，它的發射波長的峯點是在509nm，在可見光綠光的範圍下是較弱的位置。由海腎（seapansy）所得的綠熒光蛋白，僅有在498nm有一個較高的激發峯點。

在細胞生物學與分子生物學領域中，綠熒光蛋白基因常被用作為一個報告基因（reportergene）。一些經修飾過的型式可作為生物探針，綠熒光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物，並拿來映證某種假設的實驗方法。 ^[1] 

綠熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個桶，負責發光的基團位於桶中央，因此，綠熒光蛋白可形象地比喻為一個裝有色素的“油漆桶”。裝在“桶”中的發光基團對藍色光照特別敏感。當它受到藍光照射時，會吸收藍光的部分能量，然後發射出綠色的熒光。利用這一性質，生物學家們可以用綠熒光蛋白來標記幾乎任何生物分子或細胞，然後在藍光照射下進行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場馬上變得星光點點——那是被標記了的活動目標。對生物活體樣本的實時觀察，在綠熒光蛋白被發現和應用以前，是根本不可想象的。而這種徹底改變了生物學研究的蛋白質，最初是從一種廣泛生活於太平洋海域的發光水母體內分離得到的。

在大自然中，具有發光能力的生物有不少，螢火蟲是陸地上最為我們所熟悉的發光生物，中國古代還有“捕螢數百入囊內照明夜讀”的佳話。在海洋裏，某些水母、珊瑚和深海魚類也有發光的能力。特別是有的肉食性魚類專門靠一條閃着熒光的觸角來把其他小魚吸引到自己的嘴邊，《海底總動員》裏就有這種魚。事實上，大多數發光動物能發光是靠兩種物質——熒光素和熒光素酶——合作產生的結果。不同發光生物的熒光素和熒光素酶結構是不一樣的。因此，這些生物的發光本領只能是它們自己的“專利”。

20世紀60年代，一位日本科學家從美國西岸打撈了大量發光水母，帶回位於華盛頓州的實驗室進行研究。這些水母在受到外界的驚擾時會發出綠色的熒光，這位科學家希望找到這種水母的熒光素酶。然而，經過長期的重複努力，居然毫無收穫。他大膽地假設，這種學名叫Aequoreavictoria的水母能發光也許並不是常規的熒光素/熒光素酶原理。他想，可能存在有另一種能產生熒光的蛋白。此後，他進行了更多的實驗，終於搞清楚了這種水母的特殊發光原理。原來，在這種水母的體內有一種叫水母素的物質，在與鈣離子結合時會發出藍光，而這道藍光未經人所見就已被一種蛋白質吸收，改發綠色的熒光。這種捕獲藍光併發出綠光的蛋白質，就是綠熒光蛋白。這位日本科學家也因為這項發現，獲得了剛剛頒發的諾貝爾化學獎，他就是日本科學家下村修。 ^[1] 

綠熒光蛋白的發光機理比熒光素/熒光素酶要簡單得多。一種熒光素酶只能與相對應的一種熒光素合作來發光，而綠熒光蛋白並不需要與其他物質合作，只需要用藍光照射，就能自己發光。

在生物學研究中，科學家們常常利用這種能自己發光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中“揪出來”。

傳統的熒光分子在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導致被觀察的細胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠熒光蛋白髮現以前，科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態結構，而綠熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用於標記活細胞。

然而，綠熒光蛋白被發現20多年後，才有人將其應用在生物樣品標記上。1993年，馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物（如大腸桿菌等）也能產生綠熒光蛋白，這不僅證實了綠熒光蛋白與活體生物的相容性，還建立了利用綠熒光蛋白研究基因表達的基該方法，而許多現代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此，生物醫學研究的一場“綠色革命”揭開了序幕。

後來，美籍華人錢永健系統地研究了綠熒光蛋白的工作原理，並對它進行了大刀闊斧的化學改造，不但大大增強了它的發光效率，還發展出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個琳琅滿目的工具箱，供生物學家們選用。生物實驗室普遍使用的熒光蛋白，大部分是錢永健改造的變種。

有了這些熒光蛋白，科學家們就好像在細胞內裝上了“攝像頭”，得以實時監測各種病毒“為非作歹”的過程。通過沙爾菲的基因克隆思路，科學家們還培育出了熒光老鼠和熒光豬，由於沙爾菲與錢永健的突出貢獻，他們與綠熒光蛋白的發現者下村修共享了2008年的諾貝爾化學獎。

瑞典皇家科學院將綠熒光蛋白的發現和改造與顯微鏡的發明相提並論，成為當代生物科學研究中最重要的工具之一。 ^[1] 

GFP熒光極其穩定，在激發光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素（fluorescein）強，特別在450～490nm藍光波長下更穩定。

GFP需要在氧化狀態下產生熒光，強還原劑能使GFP轉變為非熒光形式，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復。而一些弱還原劑並不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脱水劑戊二酸或甲醛等。

GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用於定量測定與分析。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低於某些酶類報告蛋白。

由於GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。

1994年，華裔美國科學家錢永健（RogerYonchienTsien）開始改造GFP，有多項發現。世界上用的大多數是錢永健實驗室改造後的變種，有的熒光更強，有的黃色、藍色，有的可激活、可變色。到一些不常用做研究模式的生物體內找有顏色的蛋白成為一些人的愛好，現象正如當年在嗜熱生物中找到以後應用廣泛的PCR用多聚酶後的一波浪潮。不過真發現的有用東西並不很多。成功的例子有俄國科學院生物有機化學研究所SergeyA.Lukyanov實驗室從珊瑚裏發現其他熒光蛋白，包括紅色熒光蛋白。

生物發光現象，下村修和約翰森以前就有人研究。螢火蟲發熒光，是由熒光酶（luciferase）作為酶催化底物分子熒光素（luciferin），有化學反應如氧化，以後產生熒光。而蛋白質本身發光，無需底物，起源是下村修和約翰森的研究。

下村修和約翰森用過幾種實驗動物，和本故事相關的是學名為Aequoreavictoria的水母。1962年，下村修和約翰森等在《細胞和比較生理學雜誌》上報道，他們分離純化了水母中發光蛋白水母素。據説下村修用水母提取發光蛋白時，有天下班要回家了，他把產物倒進水池裏，臨出門前關燈後，依依不捨地回頭看了一眼水池，結果見水池閃閃發光。因為水池也接受養魚缸的水，他懷疑是魚缸成分影響水母素，不久他就確定鈣離子增強水母素髮光。1963年，他們在《科學》雜誌報道鈣和水母素髮光的關係。其後Ridgway和Ashley提出可以用水母素來檢測鈣濃度，創造了檢測鈣的新方法。鈣離子是生物體內的重要信號分子，水母素成為第一個有空間分辨能力的鈣檢測方法，是仍用的方法之一。

1955年Davenport和Nicol發現水母可以發綠光，但不知其因。在1962年下村修和約翰森在那篇純化水母素的文章中，有個註腳，説還發現了另一種蛋白，它在陽光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發強烈綠色。其後他們仔細研究了其發光特性。1974年，他們純化到了這個蛋白，當時稱綠色蛋白、以後稱綠熒光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之間可以發生能量轉移。水母素在鈣刺激下發光，其能量可轉移到GFP，刺激GFP發光。這是物理化學中知道的熒光共振能量轉移（FRET）在生物中的發現。

下村修本人對GFP的應用前景不感興趣，也沒有意識到應用的重要性。他離開普林斯頓到WoodsHole海洋研究所後，同事普臘石（DouglasPrasher）非常感興趣發明生物示蹤分子。1985年普臘石和日裔科學家SatoshiInouye獨立根據蛋白質順序拿到了水母素的基因（準確地説是cDNA）。1992年，普臘石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物學研究者就很好應用，比用蛋白質方便多了。

普臘石1992年發表GFP的cDNA後，不做科學研究了。他申請美國國家科學基金時，評審者説沒有蛋白質發光的先例，就是他找到了，也沒什麼價值。一氣之下，他離開學術界去麻省空軍國民衞隊基地，給農業部動植物服務部工作。當時他如果花幾美元，就可以做一個一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：將水母的GFP基因放到其他生物體內，比如細菌裏，看到熒光，就完全證明GFP本身可以發光，無需其它底物或者輔助分子。

將GFP表達到其它生物體這項工作，1994年由兩個實驗室獨立進行：美國哥倫比亞大學做線蟲的MartyChalfie實驗室，和加州大學聖迭哥分校、Scripps海洋研究所的兩位日裔科學家Inouye和Tsuji。

水母素和GFP都有重要的應用。但水母素仍是熒光酶的一種，它需要熒光素。而GFP蛋白質本身發光，在原理上有重大突破。

Chalfie的文章立即引起轟動，很多生物學研究者紛紛將GFP引入自己的系統。在一個新系統表達GFP就能在《自然》、《科學》上發表文章，其實不過是跟風性質，沒有原創性。

縱觀整個過程，從1961年到1974年，下村修和約翰森的研究遙遙領先，而很少人注意。如果其他生化學家願意，他們也可以得到水母素和GFP，技術並不特別難。在1974年以後，特別是八十年代後，後繼的工作，很多研究生都很容易做。其中例外是錢永健實驗室發現變種出現新顏色，並非顯而易見。 ^[1] 

作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學的許多研究領域得到應用。利用綠熒光蛋白獨特的發光機制，可將GFP作為蛋白質標籤（proteintagging），即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然後藉助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。由於GFP相對較小，只有238個氨基酸，將其與其他蛋白融合後不影響自身的發光功能，利用GFP的這一特性已經加深了我們對細胞內一些過程的瞭解，如細胞分裂、染色體複製和分裂，發育和信號轉導等。1996年，Ehrdardt等人首次報道了利用GFP的特性研究細胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細胞分裂位點形成了一個環狀物，且至少有9種蛋白在細胞分裂中起重要作用，儘管對這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特徵。利用GFP來檢測目標蛋白的定位已為我們提供了一種對細胞內的一些基本的生理過程進行更詳盡觀察的新方法。

除用於特定蛋白的標記定位外，GFP亦大量用於各種細胞器的標記如細胞骨架、質膜、細胞核等等。Shi等人曾報道將GFP融合到大腸桿菌細胞膜表面用作標記蛋白，這一技術將有助於提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研製、構建細胞生物傳感器用作環境檢測以及探測信號轉導過程等等。這些都為傳統生物學研究提供了新思路和新方法，成為交叉學科研究的熱點。

許多新發展的光學分析方法已經開始利用活體細胞來進行藥物篩選，這一技術能從數量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基於細胞的熒光分析可分為三類：即根據熒光的密度變化、能量轉移或熒光探針的分佈來研究目標蛋白如受體、離子通道或酶的狀態的變化。熒光探針分佈是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分佈情況即可推斷信號分子的遷移狀況，並推斷該分子在遷移中的功能。由於GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針。

在細胞體內分子之間的相互作用非常複雜，其中很多涉及到信號分子在細胞器之間的遷移。例如當信號分子和某一特殊受體結合後常會導致配體-受體複合物從某一細胞區域遷移到另一區域，而這一遷移過程通常會介導一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那麼該藥物即具有潛在的醫藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數量眾多的化合物中判斷出哪些化合物具有與信號分子相似的能引起配體一受體複合物遷移並介導生理反應的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經成功構建了一個篩選模型用於研究藥物介導的糖皮質激素受體（hGR）的遷移過程。在一96孔板中培養細胞，並以一編碼hGRGFP蛋白的質粒轉染該細胞。當細胞用待篩選的藥物處理後，hGR-GFP從細胞質遷移人細胞核的過程可實時或在某一時段內被證實，根據熒光分佈即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進行藥物篩選由於受其必須與遷移的信號分子相偶聯，其篩選容量相對較低，但是由於GFP在細胞內的穿透性強及獨特的發光機制，因而在藥物篩選中具有相當大的應用潛力。

近二十年來，抗體生成技術有了飛速發展，已經從細胞工程抗體（雜交瘤技術一單克隆抗體）發展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術的出現，解決了人源抗體的研製問題，促進了各種性能優良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發。單鏈抗體（Single-chainvariablefragment，ScFv）是研究得較多的一種小分子抗體，其優越性在於可在宿主細胞內大量表達，易於基因工程操作，尤其易於構建抗體融合蛋白。關於綠熒光蛋白融合單鏈抗體的報道很多，國內也有相關報道，如程虹等報道將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合GFP真核表達載體並導人小鼠成纖維細胞NIH3T3表達並獲得成功。因融合抗體具有與抗原結合及發射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應用於流式細胞儀和免疫熒光的標記及腫瘤的檢測等等。

由於技術上的的原因，一般融合抗體均置於原核表達系統如E.coli中表達。為便於表達蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一6×His序列，便於用Ni-NTA親和層析柱純化目標蛋白。但這一技術也存在一些問題。由於抗體分子內存在二硫鍵，而在原核表達系統內由於抗體不能正確摺疊，容易形成包涵體，表達出來的目標蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進行復性。但也有報道在動物細胞細胞質中成功表達出具有抗原結合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達問題，則在免疫染色及腫瘤檢測這一領域融合抗體將扮演極為重要的角色。

蛋白質工程技術已經開始採用將一具有信號傳導功能分子識別位點的分子結合到另一分子上來設計生物感受器。綠熒光蛋白由於其獨特的光信號傳導機制，以及在表達後易被周圍化學環境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適於用做活細胞體內的光學感受器。第一個基於GFP的生物感受器為Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時提出。這一感受器原理是利用鈣調蛋白結合鈣離子後引起的空間構象變化導致兩種GFP突變體間發生熒光共振能量轉移。但是由於大多數蛋白不能像鈣調蛋白那樣承受較大的空間構象變化，為克服這一缺點，人們開始提出利用基因融合技術將一新的分子識別位點結合到GFP上以構建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據這一原理將TEM1β-內酰胺酶（Bla）融合到GFP上。當缺少目標分子時，GFP處於靜止狀態不會產生熒光。但是當目標分子β-內酰胺酶抑制蛋白（BLIP）與Bla結合後，即使GFP活化產生熒光，而這一變化很容易被檢測到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術已經成為構建分子感受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應用前景極為廣闊。

GFP是一個分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產物的空間構象和功能。GFP與目的基因融合，將目的基因標記為綠色，即可定量分析目的基因的表達水平，顯示其在腫瘤細胞內的表達位置和量的變化，為探討該基因在腫瘤發生、發展中的作用及其分子機制提供便利條件。

在腫瘤的形成過程中，增殖和凋亡是一對相互矛盾的統一體。若腫瘤細胞凋亡佔優勢，腫瘤組織將長期處於休眠狀態或自行消亡。腫瘤細胞的凋亡受凋亡相關基因調控。用GFP轉染腫瘤細胞凋亡相關基因，並與正常組織進行比較，則大致可判斷此基因為抑制腫瘤細胞凋亡的基因；反之，為促進腫瘤細胞凋亡的基因。

腫瘤細胞浸潤是腫瘤細胞粘連、酶降解、移動和基質內增殖等一系列過程的表現，其根本原因在於腫瘤細胞內某些基因表達異常。利用GFP的示蹤特性，研究腫瘤細胞內某些基因異常表達與腫瘤細胞浸潤的關係，即可揭示腫瘤細胞浸潤的某些機制。 ^[2] 

新近研究發現，某些突變的GFP能夠發生熒光共振能量轉移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）。FRET是一種從熒光分子的激發狀態到臨近基態接受分子之間量子力學能量轉移的現象。FRET發生的前提條件是，熒光接受分子必須在熒光提供分子釋放態所具有的波長範圍內接受能量。如果供應分子和接受分子相互定位在幾個納米之內，則非常利於FRET的產生。因為FRET對於兩個熒光分子相互間的定位和距離高度敏感（在納米範圍內）。兩個分子間微小的線性或空間定位關係的破壞可以強烈地改變能量轉移的效率。由於FRET能量轉移並非是100%的效率，一個實用而有效的檢測FRET的方法是，僅僅激發熒光供應分子，然後計算供應分子對於接受分子熒光釋放的比率。比值的變化是一個理想的觀測細胞動態變化的指標。因為它消除了GFP分子在絕對濃度、細胞的厚度、激發源的能量度以及檢測的絕對效率等的影響。利用FRET可以作成GFP依賴的生物探針，現已有研究人員設計大分子或分子配對物來改變GFP之間原有生理信號反應的FRET。

研究發現可以通過調節GFP來改變FRET。把一個釋放藍色熒光的GFP融合到一個綠色熒光GFP突變體上，並在它們之間介入一個蛋白酶敏感的間隔子，這兩個GFP恰好可以發生FRET，當加入蛋白酶時，間隔子被切除，兩個GFP之間的距離發生彌散性改變，FRET被完全阻斷。該實驗提示我們，可以通過偶聯GFP到適當的轉錄因子、跨膜受體、細胞間信號轉導指示分子，來動態觀測活細胞的生理功能。

在上述實驗基礎上，研究人員開始設計FRET依賴的Ca²⁺敏感指示劑，其設計原理是，鈣調蛋白（CaM）通過肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）結合到CaM結合區。藍色熒光蛋白和綠熒光蛋白通過CaM和MLCK區域融合在一起，當Ca²⁺增多時，形成更多的Ca²⁺CaM複合物，並從MLCK結合到CaM結合區域。該實驗發現，通過改變兩個GFP之間的距離，可以增加FRET。另有一些研究人員，並沒有把兩個GFP融合在一個單一結構中，而是把一個GFP融合到CaM上，另一個GFP融合到CaM結合區域。結果發現，當Ca²⁺結合到CaM上，出現分子間異源二聚體，兩個GFP足夠接近而產生FRET。這個實驗提示了一個非常重要的現象，即FRET不僅可以在分子內發生，而且還可以在分子間發生。

最近，有學者用GFP依賴的生物傳感器測量活細胞內生化動力學，通過利用帶有GFP標記的蛋白激酶A轉染細胞，觀測有關cAMP的動態熒光變化。通過融合藍色熒光GFP到調節亞單位或融合綠色熒光GFP到PKA的催化亞單位，設計出了cAMP傳感器。當cAMP濃度很低時，兩個熒光分子距離很近，並出現FRET，如果增加cAMP濃度，發生FRET的可能性急劇下降。利用該方法，可以檢測出cAMP的動態變化,並開創了在整體條件下，研究cAMP調節信號轉導途徑的新方法。

GFP的結構雖然具有高度完整性，但是實驗中發現，在GFP中某些確定的位置，插入外源基因，完全沒有喪失其熒光性。當把CaM插入黃色熒光GFP突變體中，得到Ca²⁺傳感器，當Ca2+結合到CaM上，導致生色團去質子化，使熒光強度增加7倍。當在黃色熒光GFP中插入一個Zif268鋅指結構，可以得到傳導Zn²⁺的GFP，結果發現熒光少量增加，為改變前的1.7倍，Kd值約0.4mmol。插入外源基因致使GFP熒光敏感性增強的現象，提供了一個獲取永久編碼傳感器去監測細胞信號轉導的新路徑。

瑞典研究人員不再盯着植物作為樣板，轉而將目光投向擁有高超光伏轉化能力的水母，開發出提升收穫太陽能的技術。利用水母身上提取的綠熒光蛋白（GFP），該小組製作的裝置可用這些“黏黏綠”將紫外光轉化為自由電子。該小組製造的電池由在二氧化硅基底上被一個小縫隔開的兩個簡單的鋁電極組成，GFP置於兩電極中間並起連接作用。當把紫外光放進來的時候，GFP不斷將光子抓走，併產生電子進入電路產生電流。同時，GFP非常廉價，不需要昂貴的添加劑或昂貴的加工，此外，它還能被封裝成獨立的不需要外光源的燃料電池。科學家相信，此能源裝置縮小後可用來驅動微小的納米設備。 ^[3] 

在2008年的諾貝爾化學獎上，綠熒光蛋白成了主角。諾貝爾獎委員會將化學獎授予美籍日裔科學家下村修、美國科學家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學家錢永健三人，以表彰他們發現和發展了綠熒光蛋白質技術。在諾貝爾獎新聞發佈會的現場，發言人取出一支試管，置於藍光燈之下，只見這支試管中的物質發出了綠色熒光。

2008年的諾貝爾化學獎授予了從事有關“綠熒光蛋白質的發現，表達和發展”並取得重要成就的三位科學家：下村修、馬丁·查爾菲和錢永健。

2008年諾貝爾自然科學獎頒佈後，相關的介紹與報道鋪天蓋地。其中一條新聞很有意思，在諾貝爾化學獎得主下村修的出生地日本，養殖在一家水族館裏的一種多管水母也一夜成名，吸引了無數人前來參觀，因為下村修正是從這種水母身上發現了後來讓他獲獎的綠熒光蛋白。其實下村修本人的經歷，也如同這種水母一樣：作為綠熒光蛋白的發現者，幾十年來一直默默無聞，甚至他本人當初都沒有預見到該項發現的價值。如果不是後來幾位有技術、工程背景的研究人員在基礎研究和實際應用之間架起橋樑，這項發現恐怕還淹沒在論文堆中。與PCR（聚合酶鏈反應）技術一樣，又一項與生物和生命科學有重要相關的技術獲得了諾貝爾化學獎。