組織特異性啓動子

隨着基因工程技術的迅猛發展及日趨成熟，該技術在植物遺傳育種及性狀改良等應用方面日益顯示出極高的價值。啓動子基因工程載體的主要構成原件。是調控基因表達的“開關”，對外源基因的表達水平影響很大，無論是基礎研究還是應用研究，人們都希望能夠充分利用啓動子來準確控制外源基因在植物體內的表達。組織特異性啓動子又稱為器官特異性啓動子。 ^[1] 

在該啓動子調控下，外源基因的表達一般只發生在某些特定的器官或組織部位，並往往表現出發育調節的特性。 ^[1] 

其最大的優點是它所啓動的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達。從而克服了組成型啓動子啓動的外源基因在受體植物中非特異、持續、高效表達所造成的浪費，增加轉基因的效果，因此人們對特異性啓動子的研究和應用越來越重視。 ^[1] 

隴薯3號馬鈴薯試管苗，由延安大學生命科學學院提供。試劑pEGM—T vector購買於北京澤平科技有限責任公司。限制性內切酶、連接酶、Taq酶均購自上海生物工程公司；寡核苷酸引物由上海生工生物技術公司合成：其他生化試劑和常規試劑均為國產分析純。 ^[1] 

①馬鈴薯總DNA的提取取馬鈴薯試管苗葉片，採用CTAB法翻提取馬鈴薯總DNA。

② 目的片段的擴增在Genebank中查找已公佈的馬鈴薯塊莖patatin啓動子序列並利用Oligo6．0軟件設計PCR擴增引物命名為G1 (5′ GTGGAA CGG AGA CAT G IT ATC A 3 )、G2 (5′ CGCATC AAA TCA GAA ATA A1Tr GG 3 )： 以所提取的DNA為模板，G1、G2作引物，在25 μL的反應體系(含Taq酶緩衝液、dNTP、Taq酶)中，95℃ 5 min、95℃ 40 s、54℃50 S、72℃ 60 s擴增30個循環，72℃保温10 min。取5 μL PCR擴增產物進行電泳檢測，將擴增的單一條帶進行回收。

③PCR產物與T載體的連接及鑑定取上述PCR回收產物與T載體連接．採用熱激法轉化大腸桿菌DH5α，並進行藍白斑篩選，將經PCR鑑定的陽性質粒DNA用Sac I、Xho I進行雙酶切鑑定，將所得陽性重組子命名為pGEM—TG，並送往上海生物工程公司測序。

④序列分析序列同源性分析採用DNAman軟件完成，啓動子序列調控元件分析利用植物順勢調控元件數據庫PLACE和PlantCaret完成。 ^[1] 

以馬鈴薯總DNA為模板擴增所得產物經l%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為600 bp的DNA片段(圖1略)，條帶單一、整齊、明亮。

以初步篩選出來的質粒DNA為模板進行PCR擴增及經Sac I/Xho I雙酶切後電泳檢測，均獲得大小約為600 bp的單一明亮條帶(圖2略)，片段大小與預期一致．表明外源DNA片段已經連接到T載體上。 ^[1] 

將所克隆的馬鈴薯啓動子與Genebank中的馬鈴薯GBSS啓動子序列進行對比分析表明(圖3略)，克隆到的序列大小為599 bp，與Genebank中已公佈GBSS啓動子序列的同源性為99．67%，説明GBSS啓動子區序列呈現高度保守。 ^[1] 

克隆的馬鈴薯塊莖組織特異性啓動子大小為599 bp， 片段內AT鹼基含量較高。佔59．6%。採用PLACE及PlantCare在線數據庫對其進行預測分析，結果顯示：整個序列共有5個CAAT—box，分別在54，119，145，486 bp及578 bp處出現。CAAT—box一般決定着啓動子的起始頻率，5個CAAT—box表明該序列可能有較高的啓動頻率。561 bp處有TATA—box(TTTTA)，其功能是保證轉錄得以精確起始；在207 bp及461 bp處分別有AT1—motif和12 bp迴文序列，為馬鈴薯塊莖光效應的順式作用元件；在69 bp處有澱粉酶基因5 一上游保守序列(TAACAAA)：在239 bp處有種子儲藏蛋白基因啓動子核心序列(CTAACAC)；457 bp處有CTCTF結構．該序列具有根瘤細胞組織特異啓動活性保守序列：515一535 bp處有6個CACT磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因順式調控元件。以上序列分析表明，克隆的片段不僅具有完整的啓動子表達調控元件，還具有可能與組織特異性相關的特異序列(如TAACAAA、CTAACAC、CTCTF及CACT等序列)．而這些特異序列可能是基因特異表達所必須的。

在植物基因工程研究中．利用組織特異性啓動子不僅能使目的基因的表達產物在一定器官或組織部位積累，增加區域表達量，同時也可以避免植物營養的不必要浪費，並表現出發育調節的特性。Iglesias A A等試驗表明．將組成型表達的花椰菜花葉病毒啓動子和大腸桿菌ADPG焦磷酸化酶(AGPP)的表達載體轉人馬鈴薯植株中，澱粉的顆粒形態發生了變化．顯微鏡下可以看到澱粉顆粒出現了裂痕．但在馬鈴薯塊莖特異表達啓動子patatin的控制下，澱粉形態卻沒有發生任何改變。而對馬鈴薯品質的改良，歸根結底是對貯藏器官— — 塊莖中的基因表達進行調控，因此，我們已經克隆到的patatin基因啓動子及本次克隆到的GBSS啓動子，將作為一種重要的順式作用元件，為其在馬鈴薯品質改良的基因工程研究中進一步應用奠定基礎。 ^[1]