紫外光顯微鏡

詳細原理闡述

紫外光顯微鏡是使用波長在380-360nm以下的紫外光形成像的顯微鏡，這種顯微鏡最初被設計用來增大分辨力，它主要用於對紫外光有選擇吸收物質的顯微分光光度測量。

在紫外光顯微鏡中，首先遇到的是載玻片、蓋玻片和透鏡的材料問題。由於大多數普通玻璃大量地吸收340nm以下波長範圍的光，紫外光不能透過玻璃透鏡形成像;而且所有的透明塑料也具有相同的透射特性，因此不得不使用石英(可透過低達200nm的紫外光)、熒石(可透過低達185nm的紫外光)或鏗熒石等價格昂貴的材料，用這些材料已經能夠製造出具有短焦距和高數值孔徑的紫外光物鏡。另外，必須使用在紫外光區域能夠發射足夠數量輻射能的高壓氣體放電燈，一般白熾燈在紫外光區域內的輻射產量幾乎等於0。在紫外光顯微鏡中所使用的標本必須枯在石英載玻片和石英蓋玻片之間，石英載玻片比一般玻璃載玻片小而且薄，尺寸為25 x 37.5 x 0.5mm，石英蓋玻片也必須比一般玻璃蓋玻片薄得多，大約為0.025mm。使用這種蓋玻片必須矯正紫外光物鏡。此外，封藏介質和浸潤液也必須是能夠透過紫外光的，一般使用無水甘油。

在奧林巴斯顯微鏡問世之前，人們把提高顯微鏡分辨力的希望自然寄託在使用具有更短波長的紫外光上。早在1904年柯勒就已製造出了用於紫外光的石英物鏡，這種物鏡可以透過從一個弧光燈中分離的波長275nm的紫外光，並且對球面差有一定的矯正。使用紫外光顯微鏡，在分辨力上確實顯示出某種程度的提高，這一點是不可懷疑的。使用波長為265nm的紫外光拍攝未染色的人骨髓細胞塗片時，由於細胞核中的核酸顯示強烈的吸收，細胞核顯示出清晰的核質結構和較高的分辨力，儘管照片使用了很高的放大倍數，但沒有出現空放大。

然而，紫外光顯微鏡在分辨力上的增大並不能達到令人滿意的程度。首先由於波長對場深的直接影響，分辨力的增加必須要求很薄的物體標本。

在紫外光顯微鏡中對於色差問題的解決，最近20年來已經取得了一些進展，主要通過兩種方法。一種方法是使用反射物鏡，它不會受到色差的損害，但對於較高孔徑物鏡的製造是困難的，另一種方法是使用由不同的紫外光透明材料所製造的折射物鏡，在這裏最主要的問題是尋找用於這種複雜折射系統的不吸收光而且無熒光的透鏡粘着劑，對此已經找到一些合適的粘着劑，但它們對於温度上的巨大變化有時是很靈敏的。集光器和目鏡必須滿足不太高的光學要求，一般用石英制造;光源只能用氣體放電燈，特殊的電弧燈雖然能夠在紫外光的一定區域進行發射，但是往往具有較低的光產量，比較強的高壓汞燈和'燈能發射廣譜的光;此外，濾光片和單色儀對於分離所要求的紫外光是必需的，當然這也會引起光能量相當大的損失。

能否使用波長比250-350n m更低範圍的遠紫外光來形成像呢?這種打算遇到了許多實際困難，實際上這種遠紫外光顯微鏡在物理學上可能是有意義的，而在生物學上也沒有多大的價值，大多數生物學材料在紫外光範圍所顯示的吸收並不處於遠紫外的光譜區域。

現已知道，特別是在260^-320nm的範圍內的紫外光對於許多生物學材料有很大的影響，同時在生物界所存在的某些重要的物質又在這一光譜區域內表現出很強的選擇性吸收。所形成的在265nm波長上的反差是由於核酸的特異性吸收，蛋白質在280^-320nm範圍內也表現出選擇性的吸收，這種自然的吸收可以被作為紫外光顯微鏡的主要用武之地。這就使得使用紫外光分光光度計來進行核酸、蛋白質等物質的分佈定位和定量研究不僅成為可能，而且成為紫外光顯微鏡的最重要最廣泛的用途。