海葵神經毒素

海葵（sea anemone），又名海菊花、海淀根，是最原始的多細胞海洋動物之一，在分類學上屬於腔腸動物門（Coelenterata）、珊瑚動物綱（Anthozoa）、六放珊瑚亞綱（Hexacorallia）、海葵目（Actiniaria）。其下有3個目，包括海葵目Actiniaria、羣體海葵目Zoanthidea和角海葵目Ceriantharia。海葵種類繁多，分佈廣泛。海葵在中國海域分佈較廣，但產量較少。中國的海葵種類主要有：黃海葵（Anthopleura xanthogrammica）、縱條肌海葵（Haliplanella luciae）、日本側花海葵（Anthopleura Japonica）、太平洋側花海葵（Anthopleura pacifica）、暗側花海葵（Anthopleura nigrescens）、青島側花海葵（Anthopleura Qingdaoensis）、華麗黃海葵（Anthopleura elegantissima）、鬚毛細指海葵（Metridium dianthus）、疣海葵（Adamsia palliata）、紅海葵（Actinia equina）等。 ^[7-8] 

海葵身體呈輻射對稱體制，體壁由內外兩胚層組成，兩層之間是非細胞形態的中膠層。頭部由觸手和口盤組成，觸手內含有刺細胞，每個刺細胞裏都有一個特殊囊狀的細胞器，名為刺絲囊，內儲存着毒液，刺絲管盤曲在刺絲囊內，刺絲尖端為刺針，是捕食和防禦的重要武器。在受到外界物理或化學的刺激時，觸手上特異的刺細胞能釋放各種生物活性成分並通過刺絲管將毒素注入獵物體內，這些活性物質主要是肽類毒素，對人和動物具有多種生理活性。 ^[9-10] 

對海葵神經毒素研究始於20世紀70年代，1976年美國夏威夷大學Shibata等人從黃海葵（Anthopleura xanthogrammica）中分離純化了海葵神經毒素A（an-thopleurin A，Ap-A）和海葵神經毒素B（anthopleurinB，Ap-B）2種毒素，發現有增強心肌收縮的作用。1977年，Tanaka等對Ap-A的氨基酸序列進行了測定，隨後，又有多種海葵神經毒素被發現，並做了氨基酸序列測定，以及二級、三級結構的分析。1992年，Gallagher等根據天然的Ap-B的氨基酸序列，體外合成了編碼Ap-B的基因，在大腸桿菌中進行了重組表達。重組蛋白與天然的Ap-B在氨基酸組成、序列、二級結構、高壓液相圖譜及生物活性方面相同。

對海葵毒素的研究自20世紀70年代開始，已經從約40種海葵中分離到超過300種毒素，根據分子量以及生物學功能的不同，可以分為海葵溶細胞毒素（分子量約20 kDa）以及海葵多肽類神經毒素（分子量3～7kDa）兩大類。已發現超過70種的海葵神經毒素，根據其作用靶點的不同可以分為三大類，分別為作用於電壓門控鈉離子通道（Nav）的毒素，分子量為3～5kDa；作用於電壓門控鉀離子通道（Kv）的毒素，分子量為3.5～6.5kDa；以及作用於其他離子通道的多肽毒素；此外，還有部分海葵多肽類神經毒素能特異地作用於甲殼動物，但尚不清楚其具體分子靶標。 ^[11-12] 

海葵神經毒素是一類能與神經、心臟等細胞上的離子通道發生特異性結合，並改變離子通道功能的一類多肽毒素。這類毒素通常由27-59個氨基酸所組成，分子量範圍在3-7KDa 之內，大多數毒素的氨基酸序列中含有多個Cys殘基，形成分子內二硫鍵。在已報導的氨基酸殘基數介於46～49的海葵神經毒素中（另外還有幾個毒素的氨基酸殘基數介於27～31，稱短鏈神經毒素），有12個氨基酸保守。根據它們的氨基酸序列又可分為兩個亞類，以Ap-A、Ap-B為代表，屬第一亞類；以ShⅠ、RpⅠ為代表，屬第二亞類。兩個亞類之間，氨基酸序列的同源性為30%左右，而屬同一個亞類的毒素蛋白，氨基酸序列之間的同源性超過60%。 ^[14-15] 

發現的海葵神經毒素中，Ap-B表現出最強的心肌收縮活性。Ap-A和Ap-B在序列上有7個氨基酸不同，而Ap-A的活性只有Ap-B的十分之一。研究人員運用點突變技術，對Ap-B的結構與功能進行了研究。結果顯示，Arg-14、His-34、His-39和Lys-48的單點突變對活性影響不大，Asp-9和Lys-37的單點突變使Ap-B的活性下降7～12倍，而Asp-7的突變甚至使Ap-B不能正確摺疊。對疏水性氨基酸Leu-18的突變研究表明，L18V和L18A突變體的生物學活性分別下降了231倍和672倍。此外，Arg-12和Lys-49對Ap-B分辨Na+通道理化性質有決定性的作用。海葵神經毒素蛋白rhk2a和Ap-C、AsV有很高的同源性，因此推測它們也有同樣的心肌收縮活性。而且，它們的一級結構差異也可能會反映在生物活性上。 ^[16-18] 

王磊等人用激光飛行時間質譜分析測定重組表達得到的神經毒素分子量，海葵神經毒素rhk2a的分子量為5078.5Dal，其半數致死量（LD50）是1.4mg/kg（i.p.）。用ProtParam 軟件預測的rhk2a等電點為8.34。按照海葵毒素結合離子通道類型的不同，可以將該類毒素大致分為Na+通道毒素和K+通道毒素兩大類，以及結合其它類型離子通道的毒素。 ^{[13]  [19]} 

在1968年Shapiro從海葵Condylactis gigantea中純化出百慕大銀蓮花毒素（Condylactis toxin）的海葵毒素，該毒素可使龍蝦巨軸突神經元的動作電位持續時間增加。1975年，Beress等在溝迎風海葵Anemonia sulcata中首次發現了三種多肽類海葵毒素，按照1991年Norton提出的分類方法, 可以依據氨基酸序列的不同, 將這些海葵Na+通道毒素分為3種類型ATX I，ATX II和ATX III。在此基礎上，KlausHartung利用小龍蝦巨大神經元研究ATX I，ATX II和ATX III對Na+通道的作用方式，説明三種毒素對動作電位具有相似的影響。之後更多實驗證明，海葵神經毒素與蠍子毒素（α-scorpion）類似，可與Na+通道受體位點3（site 3）結合，延長Na+通道在去極化過程中的開放時間，抑制Na+通道的快速失活，從而引起一系列相關的細胞調控活動。 ^[20-22] 

來自海葵Anthopleura Xanthogrammica中的AP-A和AP-B為研究較多的海葵神經毒素。通過對AP-B進行氨基酸序列定位誘變後研究發現，AP-B中由8-17個殘基構成的不規則環狀結構在其與Na+通道接合過程中起到關鍵作用。AP-A可作用在槍烏賊、蟑螂的巨大神經軸突上，延遲INa失活而不影響其激活動力學，當作用於豚鼠心室乳頭狀肌時，50~100nmol/LAP-A可顯著減弱INa衰減速率，並增大鈉電導，使INa峯值呈使用依賴性減小，即改變其激活的電壓依賴性。 ^[23-24] 

20世紀90年代後，人們發現海葵神經毒素對K+通道亦具有高度選擇性作用。Middleton RE等經研究證明，提取自海葵Stichodactyla helianthus毒液的多肽ShK對電壓門控型K+通道Kv1.1和Kv1.3有高度親和性，並能阻斷K+通道作用，而其合成衍生物ShK-Dap22對Kv1.3的親和力是ShK的10倍。 ^[25] 

Kv3K+通道由於具有快速門控能力和高通量的性質，廣泛存在於很多中樞神經系統組織中。研究表明Kv3K+通道與一些主要的中樞神經系統失調疾病，如帕金森氏症和阿耳茨海默氏症有關。來自海葵Anemonia sulcata的海葵神經毒素BDS能特異抑制Kv3K+通道家族中的亞單位Kv3.1、Kv3.2和Kv3.4。雖然BDS與AP-A和ATX II具有25%的序列同源性，但是BDS對心臟和骨骼肌細胞上的Na+通道卻沒有任何影響。 ^[26-27] 

此外，提取自海葵Anthopleura elegantissima的海葵毒素APETx1與BDS-I、BDS-II具有42%的序列同源性，而且結構也很類似，但是兩種毒素的靶通道不同。APETx1能選擇性地抑制HERG （human ether-a-go-go-related gene）編碼的K+通道。 ^[28] 

從海葵Anthopleura elegantissima中分離出另一種多肽類毒素APETx2與BDS和APETx1分別具有36%和64%的序列同源性。但是，APETx2並不阻礙K+通道，它主要作用於感覺神經元上與調節痛覺有關的酸敏感型離子通道（ASICs）。APETx2通過與ASICs上部分亞基特異地結合，從而影響ASICs的功能。 ^[29] 

海葵神經毒素的應用價值很大。它不僅可以作為分子探針，作為研究鈉離子通道的結構與功能的工具藥，而且因其能增強心肌收縮作用又對心率和血壓沒有影響，成為研究新的抗心衰藥物的熱點。另外值得注意的是與癲癇的關係，癲癇是由於鈉離子通道突變引起的，鈉通道的狀態對病情有直接的影響。許多抗癲癇的藥物是鈉通道的阻斷劑，有的藥物是作用於鈉通道失活過程從而達到治療的效果。因此，海葵神經毒素可能是一種潛在的抗癲癇藥物。已有四種新的基因克隆重組海葵神經毒素Hk2a、Hk7a、Hk8a和Hk16a，它們從中國南海的Anthopleurin sp.海葵分離出來。分離的SD大鼠離體心房的收縮實驗己經研究了它們在心肌方面的作用機制，證明了Hk7a使心肌收縮時間最長，Hk2a使其心肌收縮程度最強。另外，在分離的SD乳鼠急性分離的神經元上，已經研究了它們對海馬神經元鈉通道的影響，結果表明Hk7a對鈉通道開放時間和概率的作用最明顯。由於這類毒素對不同的離子通道有高度的特異性和親和性，因此，不僅可以作為一種研究離子通道結構和功能的工具，而且有望開發成為診斷和治療離子通道相關疾病的藥理學試劑。 ^{[13]  [30]}