泛素連接酶E3

泛素蛋白酶體途徑是已知的所有真核生物體內具有高度選擇性的最為重要的蛋白質降解途徑，因此有關泛素化途徑的研究於2004年獲得諾貝爾化學獎。泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、結合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應：首先在ATP供能的情況下泛素激活酶E1激活泛素，然後將其轉移到泛素結合酶E2上通過硫酯鍵與E2的活性位點的Cys相連。E2可以直接將泛素轉移到靶蛋白的Lys殘基上，但一般靶蛋白的泛素化需要一個特異的泛素連接酶E3。

根據E3與底物的相對比例可以將底物分為單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。多聚泛素化修飾的靶蛋白一般被26S的蛋白酶體所降解此途徑被稱為泛素蛋白酶體途徑，簡稱泛素化途徑。多聚泛素化修飾的靶蛋白(如變性、錯誤摺疊或過量表達的蛋白質以及細胞中的許多調控蛋白)可以通過泛素化途徑被降解從而對細胞週期調控、胞吞作用、信號轉導、DNA修復、蛋白質的質量控制(例如Bsd2在膜蛋白的質量控制方面具有重要作用)、細胞凋亡等過程具有重要的作用。

單泛素化修飾是一種調節信號可以引起靶蛋白的活性、定位以及蛋白質結構的改變從而對蛋白質的胞吞途徑、膜泡的出芽、組蛋白的修飾、基因的轉錄以及蛋白質核內的定位進行調節。單獨的泛素本身並沒有任何生物功能，它只是一種分子標記蛋白，發揮作用必須在ATP提供能量的前提下依靠泛素途徑的相關酶類及蛋白酶體。Guarino等在桿狀病毒中也發現了病毒編碼的泛素，但與真核細胞中不同的是泛素在桿狀病毒中以磷脂化的形式存在於出芽型病毒粒子囊膜的內表面。桿狀病毒中泛素的功能尚不清楚，據推測可能與病毒粒子的組裝和出芽有關。

真核細胞中泛素化修飾後的靶蛋白可能被降解、可能被轉移到細胞或細胞外的特定部位，也有可能導致靶蛋白的功能發生變化，這主要取決於靶蛋白所加的泛素鏈的結構，以及泛素鏈的長短。因此蛋白質的泛素標籤並不一定是一個死亡信號，人們提出了用蛋白質翻譯後的泛素化修飾這個術語來準確地描述泛素連接到靶蛋白的這一生物事件。泛素蛋白酶體途徑可分為三步：(1)靶蛋白的識別。(2)將泛素連接到靶蛋白的特定位點。(3)通過26S蛋白酶體或者溶酶體的作用執行其相應的生理功能。

泛素連接酶E3決定靶蛋白的特異性識別，在泛素途徑中具有重要的作用。泛素連接酶E3通過調控調節蛋白的泛素化過程參與細胞內的多種生理過程。所有的E3都具有連接靶蛋白和特定E2的能力。蛋白質特定的翻譯後的修飾經常作為其相應的泛素連接酶E3識別的標誌。例如：泛素連接酶SCFc識別細胞週期蛋白依賴性蛋白激酶CDK(cyclin—dependentkinase)抑制子Sicl時就需要Sicl在其特定位點的磷酸化，否則不能被E3中的SCFc~4識別從而不能通過泛素途徑降解。這可能導致生物體不能對細胞週期進行精確調控，引起某些細胞組織或器官發生癌變。

發現鑑定的泛素連接酶E3主要有兩大類：HECT結構域家族和RING結構域家族，最近又發現了一類新的E3家族：U．box蛋白家族。HECT結構域主要是通過與泛素形成催化作用所必需的硫酯鍵發揮作用，而RING結構域為E2和底物提供居留位點從而使E2催化泛素轉移到底物上。

HECT結構域(homologoustoE6-APCterminus，HECT)家族的泛素連接酶E3s是所知的唯一的可以和泛素形成硫酯鍵中間體的泛素連接酶，並且它可以直接催化靶蛋白的泛素化。HECTE3s有一個分子量大約為40kDa的具有保守性的羧基末端催化結構域，即HECT結構域。HECTE3s的N末端不具有保守性，並且N末端決定了底物的特異性識別。例如E6AP識別HPVE6和p53就需要其一段大約200個氨基酸左右的特定的N端序列。HECT結構域至少具有四種生物學功能：(1)通過其連接特定E2s。(2)它接受來自於E2s的泛素，並且通過它的Cys活性位點與泛素形成通過硫酯鍵連接的中間體。(3)其通過催化泛素與底物上Lys側鏈的￡．氨基形成異肽鍵從而將泛素轉移到靶蛋白上。(4)它負責轉移泛素到正在延長的多泛素鏈末端從而延長泛素鏈。與HECTE3相對應的E2s構成一個亞家族，在此亞家族內每一E2成員都對特定的HECTE3s有偏愛性，這歸因於E2和HECT結構域的特異性。

HECT E3s中E6AP結構最為典型。HECTE3s中的HECT結構域有兩個通過一很小的分界面鬆散地組裝在一起的結構構成，並且兩部分之間通過一個由3個氨基酸殘基組成的鉸鏈連接在一起。HECT結構域的N端部分比較大(氨基酸殘基：495—737)，而且大部分區域為一個細長的0c螺旋結構。

N端部分還有一個80個氨基酸殘基左右的疏水性的凹槽亞結構域，此凹槽亞結構域有它自己的疏水性核心，並且通過一個疏水性界面和兩個連接子(氨基酸621-4522和702-704)與N端的其他部分相連。此凹槽的氨基酸殘基呈中等程度保守性，但在所有HECTE3s中必須保持其疏水性性質。HECT結構域的C端部分比較小(氨基酸殘基：741～852)，具有一個oc/p結構並且含有與泛素通過硫酯鍵相連的催化活性位點Cys820。Cys820定位在位於C端裂片的S9和Sl0的p鏈中間的一個由4個活性位點氨基酸殘基(Thr19、Cys820、Phe821和Asn822)組成的環(即活性環)的中間，活性環的4個氨基酸殘基在結構域相互組合時發揮作用，或者通過形成氫鍵或者通過範德華力與HECT結構域的N端部分發生作用。但活性環與N端部分之間的作用被一有具有溶解力的通道在N．C鉸鏈處隔開，鉸鏈通過非共價鍵使HECT結構域的兩部分相互聯繫，其中涉及到的氨基酸殘基(Asn603、Ile605、Pro793和Va1794)具有部分保守性。活性環具有比較高的保守性。HECT結構域的N端和C端兩部分之間有一個比較寬的裂縫。

N端裂片的靠近裂縫的部分主要是由呈極性和帶電荷(總體帶負電荷)的氨基酸殘基組成，並且其中部分氨基酸殘基Arg506、Glu539、Glu550和Asp607具有非常高的保守性，任何一個氨基酸殘基的突變都會導致與泛素形成硫酯鍵的能力降低達90%以上。而C端裂片靠近裂縫的部分是由一些保守的疏水性氨基酸組成，例如：Phe785，Leu814，Pro815，Ala842和Phe849。E6AP的最後6個氨基酸殘基(包括Phe)的刪除會導致泛素和底物之間異肽鍵的形成能力的消失，但對泛素和HECTE3s間通過硫酯鍵聯接的中間體形成影響不大。

UbcH7是與E6AP相結合的E2。UbcH7通過N端的0c螺旋和B摺疊片層結構一端的環與HECT結構域N端部分的疏水性的凹槽亞結構域相連，並且只有在HECT特異性的E2亞家族中具有保守性的Phe63連接到此凹槽的中心。已有實驗證明了此保守性的Phe63決定了HECT特異性的E2亞家族中的E2對HECTE3s的特異性。HECT結構域的N端部分具有保守性，因為此部分在HECTE3催化其與泛素形成硫酯鍵所需要的。HECT結構域的N端部分具有保守性，因為C端部分的氨基酸殘基對於催化泛素與HECTE3之間形成異肽鍵的酶活性具有重要作用。HECT結構域中具有高度保守性的活性環在N．C界面處的連接對HECTE3s催化自身和泛素形成通過硫酯鍵聯接的中間體具有重要作用。

缺乏HECT結構域的E3s在亞基組成和氨基酸序列上是多樣的，但大部分含有與E2相連的RING結構域。RING結構域家族最典型的特點是具有環指結構域(Ringfingerdomain)，RING結構域是此家族具有泛素連接酶作用的重要因素。RINGE3s中RING結構域的氨基酸序列為：Cys．X2．Cys．．Cys．X~_3-His-X23-Cys-X2一Cys-X-C__並且每一環指結構域連有兩個鋅離子。RINGE3s的E3活性依賴於環指結構域，並通過其與泛素結合酶E2相連。

以前曾有研究表明RING結構域家族的E3(RINGE3s)變構激活泛素結合酶E2從而促進由E2直接催化的底物Lys殘基的泛素化。但在與c—Cbl相對應的泛素結合酶UbcH7結構上並沒有顯著的構象變化，UbcH7的活性位點Cys與RING結構域的氨基酸殘基之間的距離最近為15A，表明RING結構域不可能提供與E2的Cys反應的位點，但並不排除c—Cbl可能誘導E2的構象變化或者對E2與泛素相連發揮其他作用。RINGE3S家族包括大量成員，如：原癌基因c—Cbl、SCF、APC和一些IAP家族成員等。現以原癌基因c—Cbl為例闡明其結構及其與E2的相互作用。

c—Cbl在與相應的E2發生作用時主要有兩部分發生作用，即酪氨酸激酶結合結構域(tyrosinekinasebindingdomain，TKB結構域)和RING結構域。TKB結構域有1個4H(four-helixbundle)，2個EF手形結構域和1個SH，結構域。RING結構域有1個3條鏈組成的D摺疊片層、1個0c螺旋和兩個大環構成，RING結構域通過與兩個鋅離子螯合穩定其結構。

RING結構域通過氫鍵和範德華作用錨定在TKB結構域的4H束上，其中涉及RING結構域中的7個氨基酸殘基和4H束中的11個氨基酸殘基，這些氨基酸殘基大都具有保守性，暗示了兩個結構域之間相對精確的排布對其行使酶的功能具有重要作用。TKB和RING結構域之間通過一個具保守性的大約40個氨基酸殘基的間插序列(被稱做連接子)相連，此連接子屬於TKB結構域的一整合部分，在c—Cbl的結構方面有重要作用，並且已有實驗證明了連接子和TKB界面的完整性對c—Cbl的E3活性是必須的。

在c.Cbl中RING結構域和連接子的螺旋結構與E2相連，但主要依靠RING結構域與E2相連。RING結構域中有一個由它的0c螺旋和兩個與鋅離子螯合的環構成的淺槽，與E2的大部分聯繫都是在此凹槽處發生。但連接子的螺旋結構通過界面含有的呈極性的氨基酸殘基和帶電荷的氨基酸殘基與E2的特定氨基酸形成分子間的氫鍵，並且連接子也與E2發生相互作用，這可能幫助解釋了某些RINGE3s與E2相連還需要一些多肽鏈的輔助。已經發現C—Cbl和其相對應的E2的特異性主要取決於c．Cbl的Trp408和I1e383以及其對應的E2的Phe63。因此相對應於c—Cbl的Trp408和Ile383和E2的Phe63位置的氨基酸殘基側鏈的性質決定了RINGE3s對特定E2的偏愛性。儘管RINGE3s中RING結構域是泛素連接酶活性所必須的，但並不是所有含有RING結構域的蛋白質都具有RINGE3的活性。例如：家蠶核多角體病毒中有6種編碼含有RING結構域的蛋白質，但只有其中的3種被證明具有RINGE3活性。另外3種無活性原因可能是因為其RING結構域中無與E2連接所需要的凹槽結構。並且此實驗組還證明了鋅離子是RINGE3s具酶活性所必需的，因為環指結構域維持其特定的構象需要鋅離子。

RING家族E3一E2複合物的作用機制還不是很清楚，人們曾經認為RINGE3s通過別構激活泛素結合酶E2從而促進由E2直接催化的底物Lys殘基的泛素化，但在與c—Cbl相對應的泛素結合酶UbcH7結構上並沒有顯著的構象變化。RINGE3s的一功能是招募E2和底物，因此它可以通過增加E2周圍底物的有效濃度促進底物的泛素化。因此人們提出了一假説，認為E2在其在E3連接部位精確安置對E3的活性有重要作用。已有很多實驗表明RINGE3s的功能可能不只是招募E2和底物，也可能對底物泛素化位點的選擇有作用，即RINGE3作為骨架使E2和底物達到最佳定位以便完成泛素由E2轉移到底物特定位點的修飾。

結構特點及其可能作用機制

U—box家族的泛素連接酶E3是真核細胞蛋白質翻譯後質量控制所必需的。此類蛋白質的c端都包含一個大約70個氨基酸殘基的從酵母菌到人類具保守性的U—box結構域，U—box的三維結構類似於RING結構域家族泛素連接酶E3s的RING結構域，是此類型的泛素連接酶酶活性所必需的。U—box蛋白家族的泛素連接酶E3開始被認為是一個多聚泛素鏈的裝配因子E4，在與E1、E2和E3的共同作用下催化靶蛋白多聚泛素鏈的形成。

後來被證明是泛素連接酶E3的一種新的類型，而其促進多聚泛素鏈的裝配反應了特定泛素連接酶E3的酶活性。U-box家族的泛素連接酶E3的作用機制開始認為和Hect家族的作用機制類似：通過U—boxdomain與泛素結合酶E2相連，然後與泛素形成通過硫酯鍵結合的中間複合體，最後催化靶蛋白的多聚泛素化修飾。但是__此家族E3的U．box結構域內部沒有保守的Cys殘基，甚至此家族的有些成員在U．box結構域中根本不含任何Cys殘基。因此這種作用機制不成立。事實上此蛋白質家族是通過U．box結構域與泛素結合酶E2相互作用從而將泛素直接從泛素結合酶E2轉移到靶蛋白將其泛素化修飾。實驗發現所有哺乳動物類型的U．box蛋白都與分子伴侶或分子伴侶協作因子相互作用，例如：此家族的泛素連接酶CHIP可以與Hsc/Hsp70相互作用。説明U．box結構域E3s可能通過與分子伴侶發生作用來識別未摺疊或錯誤摺疊的蛋白質。U．box結構域E3s作為受體調節未摺疊或錯誤摺疊的蛋白質降解，從而對蛋白質的質量控制起着重要作用。

靶蛋白通過被泛素途徑的酶E2或E3識別而被泛素化修飾，通常是通過識別靶蛋白的特定Lys殘基而將泛素連接到靶蛋白上。有時對靶蛋白的識別還需要特定位點的磷酸化並且要達到一定的磷酸化閾值。除此之外還有另外兩種識別機制，即N．end規則和一種新的區別於N．end規則的N端氨基酸殘基識別機制。N．end規則一般是針對於不穩定的蛋白質而言(若N端第一個氨基酸是Phe、Leu、Trp、Tyr、Ile、Arg、Lys和His等時此蛋白質為不穩定蛋白質)，泛素系統識別靶蛋白N端的不穩定氨基酸，然後將泛素連接到靶蛋白特定或非特定的Lys殘基的￡氨基基團上。

區別於N．end規則的N端氨基酸殘基識別機制一般是針對於某些N端並不是不穩定氨基酸殘基的靶蛋白，泛素系統識別靶蛋白N端氨基酸序列藴涵的泛素化修飾信息從而將靶蛋白泛素化標記。對於此種識別機制，LYS殘基不是必須，靶蛋白中所有Lys殘基被剔除後仍然被泛素化修飾降解，但與野生型相比泛素化修飾率偏低；與此相對應的是N端氨基酸殘基的去除則導致此蛋白質不能被泛素化修飾。此結果説明了此種識別機制中是N端氨基酸殘基而不是靶蛋白中的Lys殘基決定了靶蛋白的泛素化修飾。

但保留靶蛋白的N端氨基酸殘基而將N端氨基酸序列中的一個或某幾個氨基酸殘基替換也會導致靶蛋白不能被泛素化修飾，此結果説明了是N端氨基酸序列而不是N端第一個氨基酸藴涵了靶蛋白的泛素化修飾信息。通常靶蛋白的特異性是由E2或E3決定的，但發現多聚泛素鏈連接蛋t(multiubiquitinchainbindingproteins，MCBPs)可以將靶蛋白招募到蛋白酶體，並且對泛素蛋白酶系統特異性選擇靶蛋白起一定作用。