植物細胞融合

細胞融合，亦稱細胞雜交，是指親本的兩個細胞在特定的物理和化學因子處理下合併為一個雜種細胞的過程 ^[1]  。植物細胞融合可分為體細胞雜交和配子體細胞雜交，前者是指不經過有性過程，而直接由體細胞原生質體融

合產生雜種細胞，形成愈傷組織，並再生出植株的過程 ^[2]  ，後者是指性細胞（如小孢子四分體、精子、精細胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵細胞、助細胞和中央細胞等）原生質體和二倍體原生質體融合產生三倍體雜種細胞，形成愈傷組織，並再生出植株的過程 ^[3]  。植物細胞融合是植物細胞工程的一個重要分支，是一種突破物種生殖隔離、創造遠緣雜種的新途徑，原生質體技術還可用於細胞突變體的篩選、細胞器移植和外源DNA的導入。

自1960年Cocking用酶法分離出番茄根原生質體後，Nataga和Takebe1970年首次利用煙草葉分離原生質體，經培養獲得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次從木本植物Shamonti甜橙珠心組織誘導胚性愈傷組織，並從愈傷組織分離原生質體，經培養通過胚狀體再生出植株；在禾本科植物中，除在珍珠谷、紫狼尾草用懸浮細胞為材料，較早獲得原生質體再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生質體培養中獲得了再生植株，才出現了重大突破。現已從許多種內、種間、屬間甚至亞科間的體細胞雜交獲得雜種細胞系或雜種植株。隨着多種植物原生質體的成功培養和融合技術的不斷改進，植物細胞融合獲得了巨大成功。植物細胞融合包括原生質體的製備、細胞融合的誘導、雜種細胞的篩選和培養，以及植株的再生和鑑定等環節。

起始材料及其生理狀態對原生質體的製備及其活力有很大的影響。在以往的雙子葉植物培養中，大多以葉片為分離原生質體的材料，近年來，起始材料的適用範圍有了較大擴展。以愈傷組織、懸浮細胞和體細胞胚為材料製備原生質體是最主要的方式，禾本科植物原生質體培養獲得成功的試驗，幾乎都是用從幼胚或成熟胚誘導形成的胚性愈傷組織或胚性細胞系來遊離原生質體。採用這些材料製備原生質體方法簡便、產量高、不污染、不易破碎。

同一植物不同基因型的原生質體脱分化與再分化所要求的條件不同，所以在相同條件下，不同品種的再生能力不同。基因型的選擇在植物原生質體培養中起着重要作用，它不僅影響原生質體的產量和活力，而且還影響植株的再生。現有條件下，並不是所有植物種都能獲得原生質體再生植株。為了提高原生質體培養的成功率，要採用多品種和適當品種作為原生質體培養的起始材料。

培養基對原生質體培養影響很大。為了使原生質體能持續生長、分化，最重要的條件之一是選擇合適的培養基。在木本植物原生質體培養中，常用的培養基有MS，MT，WPM，KM8p等。利用KM8p經多次改進得到的培養基V-KM已成功地培養了200多種原生質體，是適用範圍較廣的原生質體培養基。在禾本科植物原生質體培養成功的例證中，常用的培養基是以MS，LS，Du，N6，KM等為基礎改進而來的。

無機鹽是培養基的主要成分，其濃度要比細胞培養時低。其中氮源研究較多，滲透壓過高，原生質體會發生皺縮直至失去活力；滲透壓過低，原生質體吸水膨脹而破碎，故在酶解和初培養時，由於原生質體無細胞壁，培養基保持較高的滲透勢狀態是必要的。隨着原生體培養時間的延長，可逐步降低滲透勢以提高細胞的耐受力。常用的碳源、滲透劑以葡萄糖較好，可獲得較高的植板率，且對細胞毒害也小。

原生質體培養中的激素以生長素和細胞分裂素為主。不同植物的原生質體培養，對激素的濃度要求差異很大，需要生長素和細胞分裂素的適當搭配。但也有學者證明添加NAA可提高原生質體的分裂率。在禾本科植物原生質體培養中，培養基中2，4-D的作用十分重要。

原生質體的培養方法分為液體培養、瓊脂糖包埋和看護培養幾種方式。有些植物適於採用液體淺層培養，另外，固液雙層培養法也被應用於原生質體再生

原生質體的接種密度對培養效果影響很大。密度過小，原生質體內含物外滲而引起褐變或進行一次分裂後即死亡；密度過高，造成營養不良，再生細胞團很小，而且很快停止生長。在一定範圍內，原生質體具有較強的恢復分裂能力，一般密度以10⁴-10⁵mL^-1為宜。

在木本植物 中，原生質體的分離常用的酶為纖維素酶、果膠酶、離析酶和半纖維素酶。但不同植物所用酶的種類有較大的差別。在蘋果和山桃的原生質體分離中只需纖維素酶和果膠酶即可，棗樹則用纖維素酶和離析酶。禾本科植物原生質體的分離普遍使用了Y-23果膠酶來消除細胞壁，保證了原生質體的質量。

許多研究者報道，酶解之前對材料進行預處理有利於原生質體的分離。在正常培養基中生長的草莓試管苗幼葉，直接酶解僅能產生少量原生質體，如果在分離前將試管苗轉入降低了蔗糖濃度的培養基中預處理2-3周，或暗處1周，原生質體的產量將大為提高。在實驗中，材料是否需要預處理要根據不同的情況而定。

原生質體融合方法

原生質體的融合方法經歷了一個逐步改進和完善的過程。在早期原生質體融合的方法有NaNO₃法、高pH/高Ca²⁺法、PEG（聚乙二醇）法，後來逐漸發展為PEG與高Ca²⁺、高pH相結合；20世紀80年代初又開始探索使用電融合法，並發展出一些其他方法。這些方法各有特點，但廣泛使用的是PEG法和電融合法。

配子-體細胞原生質體融合技術主要借鑑了體細胞原生質體的融合方法。性細胞原生質體對融合處理很敏感，容易與其它原生質體融合。但是因為它的形態、密度等多不同於體細胞原生質體，其融合技術與體細胞雜交有所差異。影響因素主要有融合處理方式、原生質體密度與比率、融合誘導劑的濃度等。性細胞原生質體往往形體小而密度大，為了提高融合效率，通常在提高性細胞原生質體密度的同時，相對降低後者的密度，以尋求最佳比例

原生質體融合的方式

原生質體的融合方式有兩種：對稱融合和非對稱融合。通過這兩種融合方式可產生3種類型的雜種：對稱雜種、非對稱雜種和胞質雜種。

雜種細胞的篩選

在原生質體融合後的羣體中，有融合體、未融合體、多元融合體和嵌合體，雜種細胞的篩選就是從中區分出預期的融合重組類型。主要的篩選方法有3種：①突變細胞互補選擇法。包括遺傳互補、營養缺陷互補、白化突變體之間互補以及生長激素的自主互補等。該方法的侷限性在於突變體不易獲得，而且有些突變體不易再生，所以尚未得到廣泛應用。②根據原生質體特性差異的機械選擇法。例如根據愈傷組織的顏色、熒光特性等在顯微鏡下機械分離雜種細胞。當以熒光特性作為根據時，可採用流式細胞光度計來區分雜種細胞，該法不但準確，而且效率高，用熒光化合物標記原生質體並不影響細胞再生植株的能力 ^[2]  ，但由於儀器價格昂貴，使用者還很少。③根據雜種細胞生長差異的選擇法。

一般地，配子-體細胞雜交產生雜種細胞的篩選方法是：性細胞原生質體被異硫氰酸熒光素或DAPI預染後，再與體細胞原生質體融合，在熒光顯微鏡下可清楚地完成雜種細胞的鑑定 ^[4-5]  。

雜種細胞的鑑定

獲得再生植株後，必須進一步證實雜種的真實性並瞭解它與親本的聯繫與區別。除了傳統的形態學、細胞學及生化方法得到了繼續發展外，近年來基因組DNA的RAPD和AELP分析以及細胞器DNA的Southern雜交分析廣泛應用於對稱或不對稱雜種細胞鑑定。