染色體加倍

染色體加倍的途徑有三種，即自發加倍、人工加倍和花粉愈傷組織的再生。

(1)核內複製：即染色體複製，細胞不分裂。

(2)核融合：單倍體核融合產生二倍體，二倍體和單核性核融合產生三倍體。自然加倍發生的幾率非常小。

人工加倍是指通過加入某些藥物而使染色體加倍的技術。常用的藥物為秋水仙鹼。下面以煙草植物為例，介紹如下：將煙草花葯培養中剛長出的小苗，浸入0.2%～0.4%的秋水仙鹼溶液中，24-48h後再移到新的培養基上。也可將0.4%濃度的秋水仙鹼置羊毛脂中混勻，塗在成年植株的腋芽上。經過秋水仙鹼處理的幼苗，可使加倍頻率提高到38%，成株處理的則可提高到58%。但應注意的是，經秋水仙鹼處理的植株可發生核畸變，多數花序不正常，有的只有少數花枝加倍，但也有整個花序都加倍的事例。

具體步驟為：從單倍體植株切下莖段或葉柄等組織，置固體培養基上誘導愈傷組織，其後再移植到分化培養基上進行芽和根的分化生長。愈傷組織細胞中核內有絲分裂頻率提高，所以其再生植株中二倍體所佔百分率也相應增加。如煙草莖愈傷組織加倍率可達40%。此法對F1花粉植株的加倍率可高達60%。也有研究發現，由莖愈傷組織分化的苗中常有大量多倍體產生。

染色體加倍是染色體倍性改造工程的關鍵技術之一，可分為自然加倍和人工誘導加倍兩種。自然加倍的效率較低，故在生產上應用不多，主要是採用人工誘導加倍的方法。

化學誘導染色體加倍是最常用的方法之一，使用的化學藥劑主要有秋水仙素、細胞鬆弛素B、富民農等。

秋水仙素對細胞的分裂有特殊的作用，在一定的濃度範圍內，其對細胞染色體的複製沒有什麼破壞作用，但能抑制和破壞紡錘絲的形成，對植物的初生細胞壁的形成也有抑制作用。因此，用秋水仙素處理正在分裂的細胞，可使染色體正常複製而細胞沒有分裂，從而形成同源多倍體的細胞。當處理消除後，細胞可恢復繼續分裂，由這樣的細胞產生的配子結合成合子，仍可以產生染色體加倍的後代。

用秋水仙素誘導植物的細胞加倍要處理好溶液濃度、處理時間和處理温度的關係，對處理的組織細胞狀態也應注意。不同的植物對秋水仙素的反應不同。試驗表明，有效濃度在0.000 6%～1.6%範圍內，一般以0.2%～0.5%的水溶液濃度效果較好。處理種子、組織或器官，一般不少於24 h，對已萌發的種子及幼苗處理時間可縮短。處理温度的高低對誘導加倍的成功率有直接關係。在18～25℃的範圍內，温度越高，效果越好。通常，溶液處理的濃度、時間和温度的關係是：温度低時，則濃度要大，時間要長；反之，濃度低，時間要短。正處於分裂時期的細胞對秋水仙素特別敏感，因此處理的部位應是植物細胞分裂旺盛的部位(如莖尖和芽的分生組織)。這些組織的分裂細胞多，誘導多倍體的頻率較高。需要注意的是，幼嫩組織的處理時間不能太長，超過了細胞分裂的週期，就可能使細胞再次加倍，形成更高倍數的多倍體 ^[1]  。

生物學方法主要是通過雜交方法，尤其是種間或不同屬、科間的遠緣雜交，也稱為染色體組的合併技術。該方法可按照人們的設計獲得優良基因組合的異源多倍體，從而創造動植物的新種、新類型和新品種，也可利用該技術來研究物種的進化和親緣關係。

(1)遠緣雜交技術

小麥屬及其有關植物——山羊草屬(Aegilops)、黑麥屬(Secale)、海納草屬(Haynaldia)內已進行了廣泛的雜交研究，證明了在漫長的歲月中自然發生和人工進行的種間和屬間遠緣雜交是植物進化的主要因素，並且還在生產上獲得了許多抗病、高產等優良品種，有許多已在生產上發揮了較大的作用。

遠源雜交在技術上有兩大困難：一是由於生殖隔離造成交配困難；二是即使交配成功，但因染色體組受平衡作用而難以通過減數分裂使合併的異源染色體組在後代固定下來。

生殖隔離作用表現在以下幾個方面。

1)花期不遇

有的植物生育期較長，有的則較短，有的為多年生，有的則為一年生。克服花期不遇並不困難，可採用調節播期或插期可以使父母親本達到花期相遇。

2)花芽發育的生態條件不同

花芽分化發育需要一定的春化作用和光週期誘導。一般而言，不同的種或屬的植物是長期適應一定的生態環境(主要是温度和日照)而形成的現生物種。因此，它們對温度和光照條件要求不一樣，甚至有很大的差異。例如，在小麥屬中冬性小麥和春性小麥的春化作用就不相同，冬性小麥在o～7℃、30～60 d通過春化作用，而春性小麥則在0～12℃、5～15 d可通過春化作用。因此，植物的生態條件不同而導致它們不能同地種植或花期相遇，這是造成種間雜交交配的困難之一。可以通過人工創造或模擬生態條件如温室等加以克服。

3)生殖生理反應的差異

例如，花粉在異種植物的柱頭上不能萌發，或者花粉管破裂；花粉管生長太慢，不能及時進入子房，或花粉管發育受阻，中途天折；花粉管雖然進人子房，但不能受精；有些受精後幼胚不能發育等。這些都是異種植物生殖生理的反應差異所造成的。克服的方法主要有下列幾種。

①多倍體法：把一個親本或雙親轉交成同源多倍體，可促使遠緣雜交成功。例如，用這種方法已獲得了馬鈴薯栽培種與茄屬野生種雜交成功的遠緣雜交種，實現了馬鈴薯與茄屬野生種染色體組間的合併。

②選擇適當的親本及正反雜交法：同一種的不同品種的配子與另一種或屬的配子有較大的親和力差異，亦即親和力大的親本進行遠緣雜交比親和力小的親本雜交易於成功。北京農業大學曾用5種小麥品種——河南白、農大90、燕大1817、農大183、定縣72等分別與提莫菲維種進行雜交，其成功率分別32.6%、24%、5.1%、4.1%和0%，説明河南白與提莫菲維種親和力最大，而定縣72與之最小。另一種現象也值得注意，有的植物種適合做母本，有的適合做父本。如果以適合做母本的做父本或適合作父本的做母本，則雜交難以成功，因而採用正反交法。從現有的一些資料來看，似乎有一種普通性規律：染色體數不同的種間或屬間雜交以染色體數較多的作母本，少的作父本，雜交成功率大於染色體數少的作母本與染色體多數作父本之間的雜交。其原因可能是受精過程中精子核轉入到卵細胞核的快慢和難易與精核大小(核內染色體數目的多少)有關。例如，燕麥的基本染色體數是7，它的各個種成倍性系列有14、21等。如以7×7、14×14雜交，它們的結實程度雖然有所差異，但種子發芽時都很良好；如以7×14、7×21雜交，則成功率極低，甚至完全失敗；但以21×7或14×7時，雖然受精的不多，但凡受精的種子結實飽滿，而且種子發芽良好。

③混合花粉授粉法：利用母本的花粉或同種異株花粉的刺激作用，可以解除母本柱頭上分泌的某些阻礙異種花粉發芽的特殊物質。因此，可在父本花粉中摻入少量的母本花粉，引導父本花粉管萌發並伸入到子房中，從而提高遠緣雜交結實率。例如，蘋梨雜交時常常在梨的花粉中加入極小量的蘋果花粉，有利於蘋梨雜交的成功。在混合授粉時，有時也可用幾個品種或幾個不同種、屬的花粉混合。由於不同花粉間的互相作用，改變了授粉受精的生理環境，促使遠緣雜交成功。

④重複授粉法：由於母本柱頭的成熟程度和生理狀況在不同的時間內有所差別，因而可採用不同時間內進行多次重複授粉，使父本的花粉有機會遇到最有利於受精過程正常進行的條件，促成授精率的提高。

⑤預先無性近和隨後相互異花授粉法：通常將不易雜交的一個親本的營養體嫁接到另一種植株上，使它們彼此的生理活動接近於和協，或改變其原有的生理狀態，然後再進行有性雜交這樣易於雜交成功。

⑥利用其他技術：包括利用生長激素(如萘乙酸、赤黴素)以及蔗糖液等處理柱頭或花粉。促進花粉的發芽和花粉管的牛長提高雜交成功率。

(2)體細胞雜交技術

在植物中利用體細胞雜交(somatic hybridization)可以實現超遠緣種間、屬間甚至科、目間染色體的合併。第一個成功的例子是Calson smith和Dearing在煙草屬中利用粉藍煙草和郎氏煙草兩個種問進行體細胞雜交獲得成功。

雜種細胞培養成雜種植株具有雙親的染色體組。近年來已在許多科目間進行體細胞雜交併獲得了成功，如煙草與馬鈴薯、胡蘿蔔與羊角芹、雀麥與苜蓿、番茄與馬鈴薯等都獲得了體細胞雜交而產生的雜種植株。因此，體細胞雜交是實現異源染色體合併的一個最有效的途徑，完全克服了遠源物種間雜交的生殖隔閡的障礙 ^[2]  。