抑制素

抑制素是一種由女性卵巢顆粒細胞及男性睾丸支持細胞分泌的異二聚體蛋白質激素。它選擇性抑制卵泡刺激素（FSH）的分泌，對性腺也有局部旁分泌作用。完整的抑制素分子是一個分子量約為32KD的分子，由兩個不同的亞單位（a亞單位和b亞單位）經二硫鍵連接而成。卵泡液和血清中也可以發現a亞單位。此外，遊離的a亞單位與b亞單位沒有生物活性。

DSL的二聚體抑制素BELISA使用一對高度特異的抗體，僅與有功能的抑制素B分子特異性結合，不檢測體液中的遊離a亞單位。

抑制素B由a亞單位和bB亞單位組成。抑制素B的主要作用是通過對FSH的負反饋作用調節配子發育。幾種已發表的報告均表明，抑制素B可作為一種內分泌標記物，通過對它的檢測，可以監測男性或女性的性腺功能。

DSL-10-84100ACTIVE®InhibinBELISA試劑盒使用酶增強“雙位點”“兩步”雙抗體夾心免疫測定法。在實驗中，標準品、質控及待測血清樣本都在包被有抗抑制素bB亞單位抗體的微孔板中孵育。孵育及洗板之後，所有孔都加入生物素標記的抗抑制素a亞單位的檢測抗體。再孵育及洗板之後，所有孔加入鏈黴和素-辣根過氧化物酶結合物。第三次孵育及洗板之後，加入TMB底物孵育。之後加入終止液，最後用雙波長、在450nm及620nm處測吸光度。測得的吸光度與抑制素B的濃度成正比。標準品用於描繪吸光度的標準曲線，待測抑制素B的濃度可從此曲線中讀出。

1.洗液：在100ml濃縮洗液中加入900ml去離子水稀釋。室温密封情況下可保存1個月。

2.微孔板：選擇實驗所需的板條數。剩餘不用的部分隨同乾燥劑密封放回原袋。

1.包被有抗抑制素bB亞單位抗體的微孔板（Anti-InhibinB-CoatedMicrotitrationStrips）：96孔，2-8ºC下密封保存。

2.標準品A/樣本稀釋液（InhibinBStandardA/SampleDiluent）：2ml×1瓶，胎牛血清，含0pg/mL二聚體抑制素B。使用前2-8ºC下保存。打開後2-8ºC下可保存2周。於-20ºC可長期保存。

3.標準品B-G（InhibinBStandardsB-G）：1ml×6瓶，胎牛血清，含二聚體抑制素B的濃度為10,30,100,250,500,1000pg/mL。使用前2-8ºC下保存。打開後2-8ºC下可保存2周。於-20ºC可長期保存。

4.質控（InhibinBControls）：1ml×2瓶，濃度I、II，胎牛血清，含低濃度和高濃度的抑制素A二聚體。使用前2-8ºC下保存。打開後2-8ºC下可保存2周。於-20ºC可長期保存。

5.樣本稀釋液A（InhibinBSampleBufferA）：10ml×1瓶，2-8ºC下保存。

6.樣本稀釋液B（InhibinBSampleBufferB）：10ml×1瓶，2-8ºC下保存。

7.抗體-生物素結合物（InhibinBAntibody-BiotinConjugate）（即用型）：10ml×1瓶，含生物素標記的抗抑制素a亞單位抗體。2-8ºC下保存。

8.酶結合物（濃縮）（Streptavidin-EnzymeConjugate）（即用型）：10ml×1瓶，含鏈黴和素-辣根過氧化物酶結合物。2-8ºC下保存。

9.TMB底物溶液（TMBChromogenSolution）：15ml×1瓶，2-8ºC下保存。

10.終止液（StoppingSolution）：15ml×1瓶，為0.2M的硫酸。2-8ºC下保存。

11.濃縮洗液（WashConcentrate）：100ml×1瓶，2-8ºC下保存。

操作前所有試劑都應平衡至室温(~25ºC)並充分混勻。標準品、質控及待測樣本需同時做雙份。

1.取出實驗所需板條，並記錄各孔位置。

2.在對應的孔中加入標準品、質控及待測樣本各50ul。

3.每孔加入25ul樣本稀釋液A。

4.每孔加入25ul樣本稀釋液B。

5.封板，以300-400rpm速度震盪，室温下過夜（14-18小時）。

6.洗板3次，在吸水紙上拍幹。

7.每孔加入50ul抗體-生物素結合物。

8.封板，以500-700rpm速度震盪，室温下孵育1.5小時。

9.洗板6次，在吸水紙上拍幹。

10.每孔加入50ul鏈黴和素-辣根過氧化物酶結合物。

11.封板，以500-700rpm速度震盪，室温下孵育20分鐘。

12.洗板6次，洗完最後一次以後，將洗液在孔內停留15分鐘再除去。在吸水紙上拍幹。

13.在每孔中加入100ulTMB底物溶液。

14.以500-700rpm速度震盪，室温下避光孵育15-30分鐘。

15.每孔加入100ul終止液。

16.30分鐘內在450nm處讀數。

注：必須以零標準作空白。如果能做到雙波長測定，可在600或620nm處讀數，將600（620）nm吸收值從450nm處減去，這樣可以減少光學誤差。

使用血清樣本，靜脈穿刺術採集血液。樣本於2-8ºC可保存24小時，-20ºC或以下可保存30天。避免反覆凍融樣本。不應採用溶血或脂血的樣本。冰凍的樣本在實驗前應解凍，並充分混勻。

1.計算標準品、質控、待測樣本的平均吸光度。

2.使用數據縮減軟件，用線/線或對數/對數圖分析，根據各不同濃度標準品，以濃度（pg/ml）為X軸，所測得的吸光度為Y軸作標準曲線。通過雙孔數據的平均值描繪最佳曲線。

3.在標準曲線上，按質控及待測樣本各自的平均吸光度找到相對應的濃度。

4.超過曲線最高濃度的樣本應經過0pg/ml的標準品適當稀釋後重新實驗。

5.低於曲線最低濃度的樣本應如實報告。

6.經過稀釋的值需乘以相應的稀釋倍數。如果樣本的吸光度超出了標準曲線的範圍，則此樣本可在405nm處第二次讀數，再作一條新的標準曲線（方法同上，如能做到雙波長測定，則設置600或620nm為雙波長值），取值。

1.顆粒細胞瘤：顆粒細胞瘤屬於卵巢性索間質腫瘤，可在患者體內產生雌二醇，使患者出現不同程度的第二性徵的改變，部分患者因此就診，但至少有30%的顆粒細胞瘤無雌激素活性及明顯體徵改變，給臨牀診斷帶來困難。研究表明，顆粒細胞瘤中抑制素較正常值升高數倍或數十倍，且隨腫瘤細胞的有無發生明顯變化。應用125I標記的純化牛血清抑制素抗體作為示蹤物，以RIA法測定出顆粒細胞瘤患者血清中抑制素的濃度平均為2 831 U/L，高於正常的7倍以上，陽性率為100%。並建議將絕經後婦女血清中抑制素濃度＞3 000 U/L，聯合FSH濃度＜5 U/L作為臨牀可疑顆粒細胞瘤的標準。另外，抑制素還可作為隨訪的指標之一，預測顆粒細胞瘤有無復發。抑制素很早就可監測到顆粒細胞瘤是否復發。

2.卵巢粘液性癌與其他卵巢上皮性癌：卵巢粘液性癌及交界性粘液性癌尚無有效的腫瘤標記物，臨牀上常用的CA125、癌胚抗原（CEA）等腫瘤標記物對於粘液性癌的敏感性較低，尋找理想的腫瘤標記物對於臨牀診斷與追蹤粘液性癌有一定意義。專家認為，抑制素在卵巢腫瘤惡性轉化的早期階段就升高。專家研究發現，卵巢粘液性癌分泌抑制素的能力較高，應用CA125檢測方法，卵巢粘液性癌陽性率為75%，交界性粘液性癌為11%；應用抑制素檢測，對應腫瘤陽性率各為89%、77%，均較前提高。抑制素對於交界性粘液性癌的診斷意義更大，並且在卵巢粘液性癌患者血清中的平均濃度高於其他上皮性惡性腫瘤。對於其他卵巢上皮性腫瘤如漿液性癌、子宮內膜樣癌、透明細胞癌、未分化癌等，抑制素的陽性率則低於CA125。對這些腫瘤進行診斷，需要結合血清CA125濃度。聯合應用抑制素與CA125可診斷出臨牀上90%的卵巢上皮性癌患者，在臨牀上有一定應用價值。因此，檢測抑制素亦可作為篩查卵巢上皮性腫瘤的一種輔助方法。

3.卵巢性索間質腫瘤與其他卵巢腫瘤：依靠病理學檢查有時難以鑑別卵巢性索間質腫瘤與其他腫瘤如纖維肉瘤、子宮內膜間質肉瘤、部分轉移癌等，而抗抑制素染色可以發揮輔助診斷作用。專家研究發現，性索間質腫瘤抗抑制素染色陽性。應用該方法，卵巢顆粒細胞瘤、泡膜細胞瘤、睾丸間質細胞瘤等性索間質腫瘤染色陽性，而其他腫瘤如子宮內膜間質肉瘤、胃腸道轉移肉瘤、小細胞癌等染色陰性。而且進一步指出抗抑制素抗體，特別是抗α亞單位抗體在性索間質腫瘤中表現陽性，可以用於排除與性索間質腫瘤類似的其他卵巢病變。但報道的病例較少，尚需積累資料。