引物設計

引物設計 ^[1]  是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA複製的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鍊形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是遊離的。

1、長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大於38，否則PCR的最適延伸温度會超過Taq酶的最佳作用温度(74度)，從而降低產物的特異性。

2、G十C含量：應在40%一60%之間，PCR擴增中的復性温度一般較Tm值低等於引物的Tm值減去5—10度。引物長度小於20時，其Tm恆等於4×(G十C)十2×(A十T)。

3、鹼基分佈的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3’端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G十C富集序列區錯誤引發。

4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成髮夾樣二級結構。

5、引物之間：兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。

6、上下游引物的互補性：一個引物的3‘末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。

7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端鹼基應為G或C。

8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。