基因組重排

1998年Maxygen公司的Stemmer等人提出了一種新的分子育種方法——全基因組重排技術，這種技術是分子定向進化在全基因組水平上的延伸，它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組-，因此可以在更為廣泛的範圍內對菌種的目的性狀進行優化組合。

基因組重排技術主要在傳統誘變的基礎上與原生質體融合相結合進行隨機重組，這將通過多次重組將多個親本的優良性狀集中到同一株品種，而不需要了解整個基因組的序列數據和信息。基因組重排技術雖然起源於原生質體融合，但是與原生質體融合相比，基因組重排技術允許經誘變技術處理產生的多個正突變菌種之間進行重組，並且通過幾輪遞歸基因組融合，導致最終改進的菌株涉及來自多個正突變菌株的遺傳性狀，極大增加了“複雜後代”的遺傳多樣性，並顯著提高獲得高性能菌株的機會。

基因組重排技術大致的過程可分為突變體庫的構建、原生質體融合與融合子篩選、遞歸原生質體融合三個基本環節。

首先需要對常規的菌種進行傳統誘變從而建立突變體庫，誘變的方式有紫外誘變、X射線誘變、化學誘變劑誘變等，其誘變依然有其不定向性。因此要在此基礎上篩選擁有較優良性狀的菌株構建突變體庫。

接下來是原生質體的融合，融合之前首先需要進行原生質體的製備。微生物原生質體的製備關鍵是對細胞壁的消化。目前，製備原生質體大都是利用酶解法脱去細胞壁。但由於各種微生物細胞壁組成迥異，製備原生質體的條件也各不相同。比如，在製備細菌、放線菌的原生質體時，主要使用溶菌酶作為工具酶。而對於酵母菌等真菌時，使用酶複合物或商品酶的混合液比單獨使用一種酶的效果好。

而原生質體的融合方法主要分為電擊融合等物理手段或者PEG誘導的化學手段。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實現原生質體的融合，其融合頻率高，對細胞損傷較小。PEG則是一種表面活性劑，加入後會提高融合頻率，但PEG的濃度必須處於一個特定的範圍之後，否則會對細胞造成損傷。另外融合時間、融合温度、融合菌株之間的親和力對融合效率都有影響。在融合結束時將獲得的原生質融合體離心，洗滌，重懸於緩衝液中，連續稀釋並在再生培養基上再生，獲得菌株並進行下一輪融合，重複幾輪直至獲得所需的菌株。

之後需要進行融合子的篩選，根據篩選目的不同，篩選的方式也各不相同。篩選高產的目的菌株時，主要依靠產物的物理和化學性質，如在瓊脂培養基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等。篩選對某物質具有抗性的目的菌株時，則可以利用相應的選擇培養基。此外還有一種篩選方法是親本原生質體的滅活，該方法常用的兩種滅活標記主要分為單親滅活標記和雙親滅活標記，如果親本用一種滅活方式，由於損傷的位點可能相同，所以很難通過融合來再生，如果用兩種不同的方式滅活，那麼受損的部位不同，這樣通過融合修復受損的部位在再生平板上就可以再生，雙親滅活是一種高效可靠的篩選標記，省卻了雙親的遺傳標記，提高了融合效率。

最後一步即為遞歸融合，遞歸融合即從首輪重排的融合子中選出性狀得到改進的融合子作為下一輪的親本，將其製成原生質體再進行融合，重複以上步驟直至得到理想的融合子。

微生物是生產氨基酸、抗生素、抗病毒劑和酶製劑等生物製品的重要來源。因此，如何提高微生物的產量或是增加其抗性一直以來是微生物育種的中心話題。Stemmer等在1994年率先提出DNA重排技術，該技術是一種體外定向進化分子的方法，在一定程度上模仿生物體自然進化過程中減數分裂期等位基因間的DNA片段交換。Stemmer等也首次將基因組重排技術應用於弗式鏈黴菌，研究顯示僅通過兩輪遞推式融合所得到的高產菌株就能優於歷經20年經過20輪常規誘變所獲得的高產菌株。所以基因組重排技術的優勢在於它的快速、高效。

同時，基因組重排產生的子代穩定性更高，安全性也更高，因為這個技術本身模擬了自然進化的過程，降低或消除了有害的突變。也不同於基因工程菌種，不會將外來基因拼接上去，因此產生的菌株也有更高的安全性。

基因組重排技術也無需對菌種的遺傳背景十分清晰，不同於DNA重組技術、定向進化工程、代謝工程和系統生物學手段等，使人們有可能直接得到理想中的優良性狀，在一定程度上達到了定向進化的目的，但這些技術手段都是建立在對目標菌株遺傳背景深入瞭解的基礎上，需要花費較長的時間和精力去研究不同菌株的遺傳規律。而基因組重排則無須深入瞭解微生物具體的調控機制，它以細胞內整套基因組為對象，可進行隨機交換重組整合，通過篩選最佳的“組合”，從而加快定向進化的速率，達到快速育種的目的。