基因操作技術

《基因操作技術》按照企業真實崗位設置來編寫項目，即計算機模擬構建重組載體→總DNA、質粒、mRNA和cDNA的提取、檢測和製備→體外擴增目的基因→構建含有外源基因的重組載體→重組載體轉化大腸桿菌→目的基因在大腸桿菌中的表達及純化等，最後以新型冠狀病毒核衣殼蛋白的表達為例，設計了一個模擬的客户訂單，編排成一個綜合性大實驗。每一個項目既相對獨立又彼此緊密相連，通過這些項目的實施，學生可以熟練掌握最基本的基因操作技術，並建立一個比較全面系統的工作程序框架。依照職業教育行動導向教學需要，將每個項目分成“學習目標”“項目簡介”“項目引導”“項目實施”“覆盤提升”和“項目拓展”六個部分，其中“項目實施”中的“擬定計劃”“材料準備”“任務記錄”“項目交付”以及“覆盤提升”以《項目學習工作手冊》的形式呈現，注重思政與職業素養教育。 ^[1] 

緒論

【學習目標】1

一、基因操作技術的基本概念1

二、基因操作技術的過程和內容2

三、基因工程的誕生與發展3

四、基因工程的應用6

項目一計算機模擬構建重組載體

【學習目標】10

【項目簡介】10

【項目引導】10

一、核酸數據庫11

二、 UniProt蛋白質數據庫11

【項目實施】14

任務一數據庫中查找SARS-CoV-2 N基因序列14

任務二SnapGene模擬構建pET28a（+）-N重組載體15

【覆盤提升】20

【項目拓展】20

一、生物信息學20

二、序列比對與BLAST21

項目二總DNA的提取和檢測

【學習目標】23

【項目簡介】23

一、CTAB法提取植物細胞染色體DNA23

二、SDS法抽提總DNA24

【項目引導】24

一、核酸的分子組成24

二、DNA的結構24

三、核酸濃度的測定方法26

四、凝膠電泳技術28

五、核酸的保存31

【項目實施】32

任務一SDS法提取細菌總DNA32

任務二紫外分光光度計測定總DNA濃度33

任務三瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA33

【覆盤提升】34

【拓展知識】34

一、樣品的採集和保存34

二、酚氯仿法提取全血DNA35

三、CTAB法提取植物DNA37

項目三質粒的提取及檢測

【學習目標】38

【項目簡介】38

【項目引導】40

一、載體40

二、質粒載體40

三、質粒載體的種類41

四、標記基因44

【項目實施】47

任務一鹼裂解法提取大腸桿菌質粒47

任務二紫外分光光度計測定質粒濃度47

任務三瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒47

【覆盤提升】48

【項目拓展】48

一、乳糖操縱子48

二、常用大腸桿菌表達載體49

項目四mRNA提取和cDNA製備

【學習目標】56

【項目簡介】56

【項目引導】57

一、RNA概述57

二、RNA的種類和功能57

三、RNA的結構與功能58

四、RNA的生物合成與加工61

五、RNA提取方法61

【項目實施】62

任務一Trizol法提取動植物總RNA63

任務二變性瓊脂糖凝膠檢測總RNA63

任務三mRNA提取64

任務四cDNA合成技術65

【覆盤提升】66

【項目拓展】66

一、植物病毒RNA提取66

二、cDNA的製備66

項目五體外擴增目的基因

【學習目標】71

【項目簡介】71

【項目引導】71

一、DNA的生物合成71

二、PCR的原理73

三、DNA聚合酶75

四、PCR引物設計76

五、PCR反應體系77

【項目實施】78

任務一引物設計78

任務二模板DNA提取81

任務三PCR擴增目的片段81

任務四瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物82

任務五回收PCR產物82

【覆盤提升】83

【項目拓展】83

一、RT-PCR83

二、PCR技術的應用84

三、DNA人工合成技術85

項目六構建含有外源基因的重組載體

【學習目標】87

【項目簡介】87

【項目引導】88

一、工具酶88

二、提高重組率的方法94

【項目實施】94

任務一DNA片段和質粒的雙酶切94

任務二酶切產物的膠回收96

任務三DNA片段和載體DNA的連接96

【覆盤提升】97

【項目拓展】97

一、cDNA末端快速擴增技術97

二、一步法克隆100

項目七重組載體轉化大腸桿菌

【學習目標】103

【項目簡介】103

【項目引導】104

一、感受態細胞104

二、轉化方法104

三、重組子的篩選策略105

【項目實施】106

任務一E.coli感受態細胞的製備107

任務二熱激法轉化E.coli107

任務三轉化子的篩選——菌落PCR107

任務四轉化子的鑑定——酶切驗證108

任務五轉化子的鑑定——測序及比對108

【覆盤提升】110

【項目拓展】110

一、常用表達宿主110

二、動植物細胞的轉化113

三、DNA測序115 ^[1] 

四、CRISPR-Cas9116

項目八目的基因在大腸桿菌中的表達及純化

【學習目標】119

【項目簡介】119

【項目引導】120

一、翻譯120

二、Ni-親和色譜法純化融合蛋白121

三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳122

【項目實施】124

任務一目的基因在大腸桿菌中的誘導表達124

任務二可溶性重組蛋白質的提取125

任務三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑑定目的蛋白126

任務四重組蛋白質緩衝液的置換及保藏128

任務五重組蛋白質濃度測定128

【覆盤提升】129

【項目拓展】129

一、包涵體的提取129

二、影響外源基因的高效表達的因素132

三、蛋白質印跡法133

四、蛋白質序列測定135

項目九綜合性生產實訓——以新型冠狀病毒核衣殼蛋白的表達為例

【學習目標】137

【項目簡介】137

【項目引導】138

一、接單評估138

二、方案設計138

三、項目執行138

四、產品交付139

【項目實施】139

【產品交付】144

一、產品綜合報告144

二、交貨單144

附錄

一、常用儀器設備及使用146

二、基因操作技術常用溶液的配製152

三、常用核酸蛋白質換算數據156

參考文獻 ^[1]