反相色譜

反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據溶質極性(疏水性)的差別進行溶質分離與純化的洗脱色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質也通過疏水性相互作用分配於固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質的洗脱分離。

溶質在反相介質上的分配係數取決於溶質的疏水性，一般疏水性越大，分配係數越大。當固定相一定時，可以通過調節流動相的組成調整溶質的分配係數。RPC主要應用於相對分子質量低於5000，特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可以用於蛋白質等生物大分子的分析和純化。由於反相介質表面為強烈疏水性，並且流動相為低極性的有機溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活，所以，以回收生物活性蛋白質為目的時，應注意選用適宜的反相介質。

反相介質的商品種類繁多，其中最具代表性的是以硅膠為載體，通過表面鍵合非極性分子層製備。通過控制反應時間和温度，可獲得性能穩定的反相介質。在硅膠基質的反相填料中，以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料最為常見，用途最廣。

RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基於樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相。

(1)柱長

有機小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加並不能使蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。

(2)流動相的流速。

有機小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峯的寬度就越大，分辨率就越小。製備色譜上樣過程中的流速對動態吸附容量影響很大。

(3)温度。

温度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質速度加快，使分辨率增加。同時，温度上升，分子熱運動增加，疏水性作用減弱。升高温度要考慮目標物質的熱穩定性。

(4)流動相組成。

流動相的極性越大，溶質的分配係數越大，洗脱時間越長。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脱法。水是極性最強的溶劑，在反相色譜中常常和基礎溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環也常被用作修飾劑。有機溶劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。

反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大．對於非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠《氰基<C1(TMS)<C3<C4<苯基<C8≈C18(強)。溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80 A°)的比表面積約為250 m²/g，而300A°孔徑載體的比表面積約為60 m²/g。當其他條件相同時，溶質在300A°孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80A°孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利於強親水性樣品洗脱。樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決於有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度。在反相色譜中，採用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低的保留值。固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基柱、苯基柱、C8柱、C18柱等的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8柱、C18柱，然後是氰基柱，再次是苯基柱。

據統計，近80%的有機物及無機物可以用高效液相色譜法進行分離．其中反相色譜中的C18柱是高效液相色譜中最為常用的一類色譜柱 ^[1]  。

色譜柱是HPLC系統非常關鍵的一部分，隨着色譜技術的發展，它也不斷地更新換代，長度變得越來越短，填料顆粒也越來越細。現在常用的色譜柱長度在30～250 mm，顆粒直徑在1.6～5μm。顆粒類型主要有全多孔和表面多孔，全多孔填料具有更大的柱容量、更多鍵合相選擇的優點，表面多孔具有反壓低、峯形好的優點。

最常用的基質是硅膠。以前填料純化技術不是很成熟，十八烷基鍵合到硅膠表面不是很完全，硅膠上總是少量的硅羥基裸露在外面。這樣就造成樣品在進行色譜分離的時候，會吸附或者鍵合在這部分硅羥基上，導致色譜峯拖尾。使用三乙胺作為封尾劑，先行與硅羥基吸附，可以使峯型改善，這個三乙胺曾經一度成為分析界的寶貝和機密。現在，製造填料的技術日趨成熟，人們已經掌握了把這部分剩餘未鍵合硅膠也進行鍵合鈍化的技術，這個技術就叫作封尾。

現在每家色譜柱的製造商都有其獨特的鍵合技術，常規的鍵合基團有C8、C18、苯基、氨基、五氟苯基、氰基、裸硅膠等。以下簡單介紹一下每種色譜柱的適用範圍。

1、C18柱C18色譜柱是最常用、每個實驗室必備的通用型色譜柱。填料是硅膠基質上鍵合十八烷基，有較高的碳含量和較好的疏水性，適用於大多數化合物，包括非極性、極性小分子及一些多肽及蛋白質。隨着每家色譜柱製造商的研發，C18柱的類型還在不斷增加。適用pH範圍由原來的2～8，發展到現在1～14，與純水相的兼容性越來越好，某些色譜柱即使長時間使用100%水相，也不會發生填料疏水塌陷。對於每位實驗人員來説，可供選擇的範圍日趨廣泛。

2、苯基柱苯基柱與C18柱相似，是在硅烷基上鍵合一個苯環。這造成了對於有些特殊的化合物(如芳香族化合物)在反相保留時與C18有不同的選擇性。在某些條件下，可以將C18無法分離的化合物分離。

3、五氟苯基柱五氟苯基柱的填料顆粒是硅烷基上鍵合一個五氟苯基。與常規的C18保留機制相似，但提供了不同的分離選擇性，提高了對極性樣品的保留，特別是對鹵族化合物。

4、氨基柱氨基柱是在硅膠的硅羥基上鍵合了酰胺基，屬於HILIC模式的色譜柱，其保留機制比較複雜，主要是液液分配、吸附作用、離子相互作用和親水性保留作用的多模式組合。主要用於分析極性大的化合物，還適合用於糖類化合物的分析，如1，5一脱水葡萄糖醇。主要的優點是可以使用高有機相分析反相保留弱的化合物，對質譜離子化有更好的兼容性，提高檢測靈敏度。

5、裸硅膠柱未雜化的硅膠顆粒色譜柱在日常的分析中也常用於液相色譜一質譜聯用方法，硅膠柱與氨基柱有相似的保留基質及優點，同屬HILIC模式的色譜柱。主要用於極性化合物的分析，特別是強極性鹼性水溶性化合物，如生物鹼、腎上腺素系列 ^[2]  。

在液質聯用中，一般均使用極性溶劑進行洗脱。反相色譜中洗脱強度順序為：水<甲醇<乙腈<乙醇≈丙酮，親水作用色譜中洗脱強度順序為：丙酮<乙腈<乙醇<甲醇<水。通常可以通過改變流動相的溶劑強度和類型來改善化合物的保留和選擇性。

改變流動相洗脱能力通常會引起保留時間的改變，部分化合物可以此作為改善分離度的手段。但有些化合物通常是結構類似的化合物，不能通過改變溶劑強度而增加分離度，這時改變流動相的組分，例如，調整pH、添加緩衝鹽或離子對試劑可能是個可行的選擇。對於某些不能有效分離的化合物，使用兩種混合溶劑(甲醇和乙腈)作為有機相，可能會得到不錯的分離效果。

串聯質譜在使用緩衝鹽時需要考慮是否與質譜兼容，必須使用揮發性試劑。通常使用甲酸、乙酸、氨水作為pH調節劑，甲酸銨、乙酸銨作為緩衝鹽，三氟乙酸和三乙胺作為離子對試劑。有以下幾點需要注意。

(1)甲酸、乙酸、氨水與甲酸銨、乙酸銨一起使用具有最大的緩衝效率，注意鹽在溶劑中的溶出度，防止析出。

(2)在負離子模式下加入酸，會抑制大部分化合物的質譜信號響應。

(3)在調節流動相pH前，必須充分了解所用色譜柱的pH範圍，如超出，將大大降低色譜柱壽命。

(4)親水作用色譜一般會使用5～50 mmol/L的鹽，來達到改善峯形和保留的目的。

反相介質性能穩定。分離效率高，可分離蛋白質、肽、氨基酸、核酸、甾類、脂類、脂肪酸、糖類、植物鹼等含有非極性基團的各種物質。

例如使用C8和C18改造的硅膠柱的高壓液相來製備和分析四環素類抗生素，對於四環素類抗生素來説．用氧化鋁、硅膠、離子交換樹脂等來進行製備性分離會顯得極性太強。反相色譜硅膠Lichroprep RP一18和RP一8的發展提供了一個新的分離介質。應用四環素、土黴素、金黴甲烯土黴素和強力黴素作材料，用Lichroprep RP一18高效低壓柱，溶劑系統中甲醇、乙腈、0.1 mol/L乙二酸(pH 3.0)的配比為5：0.5：10，能成功地在這幾種抗生素的混合物中有效地分離出四環素、金黴素、甲烯土黴素和強力黴素。

作為產品純化製備手段，應用反相介質分離，相對價格較高，多限於實訓室規模的應用，在大規模工業生產中應用較少 ^[3]  。