半數組織培養感染劑量

半數組織細胞感染劑量（TCID₅₀）通常指病毒感染雞胚、動物或細胞後，引起50%發生死亡或病變的最高病毒稀釋度。TCID₅₀的測定可以估計病毒感染性的強弱及病毒的含量，但不能準確測定感染性病毒顆粒的多少 ^[1]  。

掌握TCID₅₀測定的原理、試驗方法、分析結果和計算。

TCID₅₀及半數培養感染劑量(50% tissue culture infectivedose)，以使50%的試驗培養細胞出現感染反應的病毒稀釋液的稀釋度倒數的對數值來表示。多數病毒感染體外培養的細胞後，常引起細胞形態學改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(cytopathic effect，CPE)，可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色識別和判斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特徵可以測定病毒的毒力。

它所測定的不是病毒顆粒的數目，而是病毒感染反應的有或無，嚴格説來是一種定性測定法。但是因為感染反應的有或無與病毒顆粒數目之間有一定定量關係，且該法靈敏度高，重複性好，所以仍廣泛用於病毒的定量測定，特別是應用於某些病毒的試驗診斷及病毒毒力和宿主抗性的定量分析。

在從事藥物的抗病毒試驗中，常用100TCID₅₀的病毒感染量進行。測定時，首先在微量細胞板上培養敏感細胞，待細胞貼壁形成單層時，棄上清液。將待測病毒用維持液做連續10倍系列稀釋後加入細胞單層，逐日觀察，直至病毒產生的CPE不再進展為止。具體時間根據病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖迅速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也較快，因此48～72h也可以觀察、染色、計算 ^[2]  。

(1)Hela細胞系。

(2)0.2%EDTA溶液(無鈣、鎂離子的PBS配製)，68.95kPa蒸汽滅菌(115℃)10min。

(3)1萬單位/ml青黴素、鏈黴素。

(4)1640培養基、新生小牛血清。

(5)7.5%NaHCO₃真空抽濾除菌。

(6)脊椎灰質炎病毒I型(疫苗株)。

(7)稀釋液同細胞維持液。

(8)細胞生長液：1640+10%新生小牛血清。

(9)細胞維持液：1640+2%新生小牛血清。

(10)無菌青瓶及瓶塞、無菌10ml吸管及吸耳球、無菌100ml三角瓶(盛培養基用)、燒杯、無菌試管。

1、單層細胞製備

Hela細胞於青瓶中37℃培養24h，待生成單層後備用。

2、病毒液稀釋

病毒液作10倍稀釋，先將稀釋液分裝於10個試管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒懸液加入第一管中，搖勻後為10^-1，換一支吸管，在10^-1病毒液中吸放3～4次，取0.1ml放入第二管中搖勻後為10^-2........，如此稀釋至10^-10。

3、病毒接種

將40個已長好細胞單層的青瓶中的培養液倒掉，取上面已稀釋好的病毒液接種於細胞單層，每瓶0.1ml，10^-3～10^-10每個稀釋度分別接種4瓶，另取病毒原液接種4瓶細胞，每瓶0.1ml，作為病毒對照。再取4瓶細胞分別接種0.1ml培養基作為正常細胞對照。接種完畢後一起放入37℃温箱內，吸附1～1.5h。

4、結果觀察

吸附完畢後倒掉病毒液或稀釋液，每瓶細胞中各加入1 mI細胞維持液。置37℃培養，24h後觀察結果，並按下表記錄結果。觀察時先看正常細胞對照，然後看試驗瓶細胞。

5、實驗結果的分析與計算

(1)實驗結果。

(2)計算

根據Reed—Muench公式

半數效應劑量(LD₅₀，ID₅₀或TCID₅₀等)=50%感染的高臨界稀釋度倒數的對數+距離比×稀釋係數的對數

式中：距離比=（50%的臨界感染率-50%）/（50%的臨界感染率-50%的低臨界感染率）

在上例中：

TCID₅₀=lg(1/10^-5)+（80-50）/（80-20）xlg10=5.5

該病毒樣品的TCID₅₀效價為10^-5.5。 ^[3]