共焦顯微

激光掃描共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源，在熒光標記標本的焦平面上逐點掃描，採集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT)，再經過信號處理，在計算機監視屏上形成圖像。對於物鏡焦平面的焦點處發出的光在針孔處可以得到很好的會聚，可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑，對比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨着距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過針孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近為0%），因而在探測器上產生的信號就越小，影響也越小。正由於共焦顯微僅對樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的分辨率，並在生物學中獲得了廣泛的應用。

共聚焦顯微鏡主要由五部分組成：顯微光學系統、掃描裝置、光源、檢測器和應用軟件系統。整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平台界面中方便靈活地進行。

（1）顯微光學系統：

顯微鏡是共焦檢測系統常用的組件，是系統成像質量的核心部分。顯微鏡光路一般採用無限遠光學系統結構，可以方便地在其中插入光學元件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑、平場復消色差物鏡，有利於熒光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換、濾色片組的選取、載物台的移動調節、焦平面的記憶鎖定等都可以由計算機自動控制。

（2）掃描裝置：

掃描裝置是激光共聚焦檢測系統進行大範圍檢測必需的組件，通常有由絲槓導軌組成的XY平移掃描、由陣鏡擺動的掃描等方式。前種掃描方式可以實現大範圍區域的掃描，而後者掃描範圍相對小一些，不過陣鏡擺動掃描可以很快，圖像採集速度可以大大提高，有利於對那些壽命短的離子作熒光測定。掃描系統的工作程序由計算機自動控制，與信號採集相對應。

（3）光源：

光源有單色光（激光）和多色光（汞燈、氘燈、鹵素燈等）。激光源可以使用多譜線氬離子激光器，它提供發射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光；另外，氦氖綠激光器提供發射波長為543nm的綠光，氦氖紅激光器提供波長為633nm的紅光。激光源還可以用其他半導體激光器。

（4）檢測器：

檢測器通常採用光電倍增管（PMT）、光子計數器等，通過高速A/D轉換器，將信號輸入計算機以便進行圖像重建和分析處理。通常在PMT前設置針孔，可以採用固定大小針孔或由計算機軟件來控制的可變大小針孔。如果是檢測熒光，光路中還應該設置能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要；也可以採用光柵或稜鏡分光然後進行光譜掃描。

（5）應用軟件系統：

應用軟件系統可以根據具體需要設置各種功能，但有一點是共同的，就是將掃描位置座標與檢測器接收的信號一一對應起來，並以圖像的方式進行儲存與顯示。

共焦顯微鏡從產生至今獲得了巨大的發展，掃描方式從最初的狹縫掃描方式（掃描速度較快，圖像分辨率不高），到階梯式掃描技術（提高了圖像分辨率，標本製備要求太高），再到驅動式光束掃描器（掃描速度較快，符合共聚焦原理）。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的光源設計和分光采集技術也有較大的改進，主要集中在如下幾個方面：

（1） 現代的激光掃描共聚焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器。選擇激光光源時，一方面要滿足研究工作對波長的需求，另一個方面要考慮到激光光源的壽命。

（2）最新一代激光掃描共聚焦顯微鏡可以用稜鏡狹縫分光的新技術，配上合適的激光源後，能夠擺脱傳統的波長濾片組的限制，連續和自由地選擇最佳波長。

（3）用於激光掃描共聚焦顯微鏡的物鏡也做了較大的改進，不但具有平場復消色差特性，而且能與高速掃描功能相匹配。

共焦顯微鏡發展至今又產生了新的類型，如針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡和雙光子共聚焦顯微鏡：

（1）針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡：

針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡是為了解決快速變化過程的共聚焦檢測問題而提出的，其核心是雙碟片專利技術，由日本Yokogawa Electric公司發明，包括微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉。

與常規激光共聚焦方法不同，針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡採用CCD作為探測器，無需載物台進行掃描運動，只要微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉，就可以對物體進行快速共焦檢測，最高全幅採集幀速度達到1000幀/s，是活細胞在體熒光成像的重要工具。

（2）雙光子共聚焦顯微鏡：

雙光子共聚焦顯微鏡是為了解決生物檢測中樣品染料標記的光漂白現象而提出的，因為共焦孔徑光闌必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發出的熒光，包括從焦平面發出的熒光，這樣就要求激發光必須足夠強以獲得足夠的信噪比；而高強度的激光會使熒光染料在連續掃描過程中迅速褪色（即光漂白現象），熒光信號會隨着掃描進程的進行變得越來越弱。除此之外，還有光毒作用問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產生諸如單態氧或自由基等細胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發光的光功率密度以保持樣品的活性。針對活性樣品的研究，尤其是活性樣品生長、發育過程的各個階段，光漂白和光毒現象將使這些研究受到很大的限制。

雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個較低能量（即更長的波長）的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間後，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個能量較高（即波長為長波長一半）的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈衝激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峯值能量和很低的平均能量，其脈衝寬度只有 100 飛秒，而其週期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈衝激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子共聚焦顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。

雙光子共聚焦顯微鏡有很多優點：（1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；（2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；（3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；（4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子共聚焦顯微鏡比普通共聚焦顯微鏡更適合用來觀察厚標本、活細胞，或用來進行定點光漂白實驗。

共聚焦顯微鏡有較高的分辨率，而且能觀察到樣本隨時間的變化。因此，共聚焦顯微技術在生物學研究領域起着不可或缺的作用。以下為共焦顯微技術的幾個主要應用方面：

（1）組織和細胞中熒光標記的分子和結構的檢測：

利用激光點掃描成像，形成所謂的“光學切片”，進而可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像，因此可以用於觀察切片和一些表面不平的標本，特別是研究具有長突起的神經元時更有使用價值。同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析。

（2）定量或半定量測量Ca2+和pH等細胞內離子濃度及變化：

激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像，這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。最好與電生理等技術相結合來觀察離子變化與電生理學指標的相關性。

（3）熒光光漂白及恢復技術：

利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區域的某種熒光淬滅，然後觀察鄰近相同的熒光標記物重新擴散入該區域的速度和方式，從而分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。

（4）長時程觀察細胞遷移和生長：

激光掃描共聚焦顯微鏡的軟件一般均可自動控制地進行定時和定方式的激光掃描，而且由於新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測效率的提高，只需要很小的激光能量就可以達到較好的圖像質量，從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷，因此，可以用於數小時的長時程定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。

（5）其他的生物學應用：

用高能量激光束進行細胞損傷和損毀實驗，一般要用紫外激光束進行細胞損毀；細胞間通訊研究；光解籠鎖活化技術等。