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免疫沉澱
鎖定
免疫沉澱影響因素
混合單克隆抗體 | 單克隆抗體 | ||
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反應強度 | 極好 | 抗體依賴性(極差到極好) | 極好 |
一般良好(有時本底高) | 極好,但有些出現交叉反應 | 極好,避免使用有交叉反應的抗體 | |
優點 | 穩定,多價反應特異 | 供應不受限制穩定,多價反應特異 | 供應不受限制 |
缺點 | 本底不易清除 | 需對抗原有高親和力 | 供應不普遍 |
免疫沉澱要求抗原的純度儘可能提高。降低本底,用不與待檢抗原結合的非特異性抗體預處理,可以從抗原溶液中除去非特異性結合蛋白,即此法第一次是用非免疫抗體降低本底,第二次再用所研究的抗體,這樣進行二次免疫沉澱是達到純化免疫沉澱物最有效的方法。
免疫沉澱實驗步驟
(2) 取少量裂解液以備Western blot分析,剩餘裂解液將1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜;
(3)免疫沉澱反應後,在4°C 以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底;將上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解緩衝液洗3-4次;最後加入15μl的2×SDS 加樣緩衝液,沸水煮10分鐘;
(4)SDS-PAGE, Western blotting或進行質譜分析。
免疫沉澱實驗細節
免疫沉澱的實驗過程比較簡單,一般分為3個階段;①抗原溶液的製備;②裂解物非特異性本底的預處理;③免疫複合物的形成與純化。 免疫沉澱的第一步是製備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉澱的材料來源,但免疫沉澱一般採用細胞或組織製備的裂解物。裂解物的製備可採用多種方法,其中首選用温和的去污劑如非離子去污劑來裂解細胞。該方法能溶解細胞膜,破壞蛋白質之間許多微弱的相互作用,釋放出大多數細胞內抗原。更重要的是方法十分温和,不破壞大多數抗原的結構和酶的活力。如果對抗原結構的完整或活力要求不嚴,或者抗原結合較為緊密,可以採用比較劇烈的條件來製備裂解物,如在強變性劑的溶液中進行煮沸,然後在免疫沉澱前經過稀釋去除變性劑。一旦細胞裂解液製備好,即可進行預處理。
免疫沉澱一般用於分析抗原的生化特性,因此要求抗原的純度儘可能高。抗原和抗體的相互作用與其各自的內在性質有關,故提高該技術信—噪比最容易的方法是降低本底。