丹蔘素

SALVIANIC ACID A

SALVIANIC ACID A SODIUM SALT

(r)-a,3,4-trihydroxybenzenepropanoic acid

3-(3',4'-Dihydroxyphenyl)-(2R)-lactic acid

Danshensu

dan shen suan a

(R)-2-Hydroxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid

在乙醇中測不出旋光度，FeCl₃反應呈黃綠色。

紅外光譜（KCl，cm^-1）顯示COOH（1732，2750～2550）和OH（3450～3150）的存在。

核磁共振譜(CD₃)₂CO δ：2.86（2H，八重峯），4.30（1H，四重峯）； 6.60（1H，雙峯，J=7Hz），6.80（1H，單峯），分別顯示典型的ABX型（Ar2CH22CH2CO）和3個芳香質子的存在。¹³C核磁共振δ143.3表示兩個羥基互為鄰位，其質譜裂解為典型的A開裂。

其鈉鹽為白色針狀結晶，熔點255～258℃。

取該品粉末1g置試管中，加乙醚5ml，振搖，放置1h，濾過，濾液揮幹，加醋酸乙酯1ml溶解，作為供試液。另取丹蔘酮ⅡA對照品，加醋酸乙酯溶解作為對照品溶液。用硅膠G薄層板，各點樣5μl，以苯-醋酸乙酯（19:1）為展開劑，展後取出晾乾，自然光下觀察，顯暗紅色斑點。

丹蔘藥材，粉碎，加12倍量水，浸泡過夜， 煎煮兩次，每次2h。合併提取液，濃縮至密度1.3，加70%乙醇沉澱，回收乙醇。用乙醚萃取兩次，水層用飽和食鹽水鹽析，過濾鹽析物，濾液放置得到的白色沉澱物在水中重結晶得丹蔘素，含量約為98%。

根據丹蔘素的物理、化學性質，丹蔘素提取工藝採用水提醇沉法，因此丹蔘素水提液中含有大量蛋白質、鞋質等水溶性其他成分，會影響丹蔘素水提液作為注射劑的應用,為了達到《藥典》對注射劑的相關要求，需加入高濃度的乙醇來達到除雜目的，一般乙醇濃度要達到75%和85%，根據相關文獻報道，人高濃度的醇會破壞丹蔘素，使丹蔘素損失較大：70%醇沉丹蔘素損失46%，80%醇沉丹蔘素損失68%。

水提工藝：取丹蔘原藥材，水提前浸泡1h，加12倍量水，煎煮2次，每次煎煮2h；把兩次煎液合併，過濾。水提液濃縮，水提液至每毫升相當於2g原藥材，加入95%乙醇沉澱2次，醇含量分別達到60%、70%，每次醇沉後，水提液靜置48h（0°C-4°C）後，濾過，分別濃縮至相對密度為1.20-1.25和無醇味，濃縮後，加入蒸館水補水，使每毫升水提液相當於2g原藥材，將PH調至8（1mol/L NaOH），加熱煮沸1.5h，過濾，將PH調至3（10%HCl），水提液靜置48h（0°0-4°0後，過濾，即得實驗所需的水提液 ^[1]  。

dl-丹蔘素的傳統合成方法是通過嚼挫酮、丙稀酸、丙酮酸的製備，最後經Clemmensen還原得到。該方法的缺點在於反應時間長，產物不均一，產率較低。雖然有學者提出改進方法，但仍是在原路線的基礎上對某一步驟的優化，整體上效果改善不明顯，因此在查閲相關文獻的基礎上，重新設計dl-丹蔘素合成路線。

首先對丹蔘素苯環結構上的乳酸側鏈的合成進行了優先考慮，起初用苯甲酸與丙二酸二乙酷縮合得到丙烯酸結構，再通過加成反應在a位引入羥基，經查閲此反應，羥基均被引入β位，α位上的引入較困難，所以只能變換其他方法，之後又考慮到Datzens環氧化，再通過開環的方式引入羥基，相關數據庫對此反應已有大量報道，而且開環後經基處於α位而非β位，是一個相當成熟的反應；其次，苯環上直接上徑基並非易事，只能通過其他基團的轉化來間接引入或者直接使用帶有羥基的原料，考慮到時間和成本，選用鄰二經基苯，綜上所述，起始原料暫定為鄰二經基苯甲醛，而且廉價易得 ^[2]  。

丹蔘素主要來源於植物提取，然而植物丹蔘中較低的丹蔘含量和提取效率嚴重製約了丹蔘素的大規模應用。化學合成丹蔘素也存在着步驟繁瑣，產物光學異構性低等缺點。因而利用代謝工程和合成生物學技術構建重組工程菌，採用生物發酵方法生產丹蔘素是一種很好的替代方法。然而，丹蔘素的生物合成途徑一直未見報道。本文中我們本創新的組合了E. coli內源的羥基化酶HpaBC和植物乳桿菌（Lactobacillus pentosus）中的D-乳酸脱氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）成為非天然存在的人工丹蔘素合成途徑。該人工途徑以4HPP為前體，在HpaBC的催化下實現苯環的間位羥基化，繼續在 D-乳酸脱氫酶的作用下還原酮基合成L-酪氨酸重要衍生物-丹蔘素。

研究者探討了 D-乳酸脱氫酶（d-ldh）和 4-羥基苯乙酸間位羥化酶（hapBC）共表達實現丹蔘素生物合成的可能性，發現兩個基因協同表達可以實現以4HPP和L-酪氨酸為底物合成丹蔘素。而來自植物乳桿菌中的D-乳酸脱氫酶（d-ldh）的兩個突變體d-ldhY52V和d-ldhY52A比野生型有着更高的催化活性，而d-ldhY52A活性最高。構建d-ldhY52A和hpaBC 共表達載體pYBD4並轉化L-酪氨酸生產菌株BKT5構建得到丹蔘素生物合成工程菌株BKD5。分批補料發酵顯示菌株BKD5有着很高的丹蔘素合成能力，在72h消耗13.7g/L的葡萄糖可以合成7.14 g/L的丹蔘素，轉化效率達到0.47mol/mol。對發酵液中副產物如乙酸和胞內丹蔘素含量的檢測，發現於發酵後期菌體更傾向於乙酸的積累從而抑制了丹蔘素產量的提高，並提出通過敲除pta和ackA基因以阻斷乙酸的合成可能進一步提高丹蔘素的產量 ^[3]  。