香豆酸

中文名稱：香豆酸

CAS NO.：500-05-0

中文別名：α-吡喃酮-5-甲酸

英文名稱：Coumalic acid

英文別名：Coumalicacid; 98%; Coumalicacid; 2-oxo-2H-pyran-5-carboxylic acid; 2-Pyrone-5-carboxylic acid; Coumalic acid, (2-Pyrone-5-carboxylic acid); 2-oxo-2H-pyran-5-carboxylate

EINECS：207-899-0

分子式：C₆H₄O₄

分子量：140.09

對香豆酸有順式和反式兩種，反式對香豆酸為白色細針狀晶體，熔點212℃-214℃，略溶於冷水，溶於熱水、甲醇、乙醇，微溶於苯和氯仿，不溶於二氯甲烷和石油醚。

生產對香豆酸的方法有化學合成法、天然提取法和生物轉化法。化學合成法是通過對輕基苯甲醛和二酸反應得到對香豆酸。天然提取法多是通過鹼解植物細胞壁來獲得對香豆酸。而生物轉化法是對香豆酸通過微生物酶轉化而成。Huang等人從白腐真菌找到一種耐熱的轉醛醇酶(TAL)，可以將酪氨酸轉化為對香豆酸，己申請專利 ^[1]  。

由於可形成共振穩定的酚自由基，對香豆酸具有良好的抗氧化活性。它對過氧化氫、超氧自由基、輕自由基、過氧化亞硝基有強烈的清除作用，對單線態氧有淬滅作用。在淬滅自由基的同時，對香豆酸還能抑制產生自由基的酶，促進產生清除自由基的酶。

香豆酸對金黃色葡萄球菌等四種不同的菌株，其最低抑菌濃度(MIC)均為250微克/毫升，對枯草桿菌等也有效。Bodini等人進一步研究發現，對香豆酸能充分的抑制紫色色桿菌5999(Chromobacterium violaceum 5999)、農桿菌NTL4 (Agrobacteriumtumefaciens NTL4)和綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)的羣體感應(QuorumSensing)作用，從而達到抑菌效果。

研究表明，對香豆酸對於博來黴素(bleomycin)、過氧化氫和IQ型喳琳致突變物所誘導的沙門氏菌突變有良好的抑制作用。對香豆酸還能抑制混合功能氧化酶活性,以及環磷酞胺(CP)引起體細胞和性細胞突變。

此外,對香豆酸還是許多具有較高應用價值的化合物的前體或中間體。例如,對香豆酸可以通過氧化，環合反應合成香豆素；對香豆酸通過降解反應生成對輕基苯甲酸；對香豆酸還可作為祛痰藥杜鵑素的中間體。因此，對香豆酸廣泛的應用於食品、化工、醫藥行業 ^[1]  。

（1）準確稱取樣品100 mg於10 ml離心管中；

（2）沿着離心管壁加入5.0 ml去除空氣的2.0 M NaOH溶液，小心充入N₂，排出試管中的空氣(充N₂過程中需小心)；

（3） 39°C避光培養24h，期間隔一段時間搖晃一次，使飼料能被均勾充分的鹼解。

或者

（1）準確稱取詞料樣品100 mg於10 ml反應釜中(聚四氟乙稀內襯，不鏽鋼外套)；

（2）加入5.0 ml去除空氣的4.0 M NaOH溶液，小心充入N₂，排出試管中的空氣(充N₂過程中小心將樣品吹出)，蓋好聚四氟乙稀蓋和旋緊不鏽鋼蓋；

（3）烘箱中170℃反應2 h,冷卻後轉移到10 ml離心管中。

以上兩種方法釋放出的酷酸萃取方法如下(整個過程需注意避光)：

（4）分別取上述溶液1.0 ml於新的離心管中，加入濃H₃PO₄，用精密pH試紙(0.5-5.0)將pH調至2.0以下，混勻後4°C過夜。

（5）向試管中加入4.0 ml乙酸乙酷，禍動2 min，使其充分混勾，6000 g離心15 min，取上清液(因樣品不同，有時離心後會出現膠凍樣層，因此，此步驟中離心轉速需根據不同的樣品進行調整。如果出現膠凍樣層，此時需加大轉速或增加離心時間)；

（6）重複步驟(5)，將兩次上清混合；

（7）N₂吹乾儀將乙酸乙酯吹乾，

（8）加入1.0 ml甲醇復溶,禍動1min，過0.45微摩針孔濾膜，進行液相檢測，根據色譜峯的面積計算詞料中香豆酸的含量 ^[2]  。

色譜柱：SymmetryC18 反相柱(Waters,250 x 4.6 mm, 5 jim, pH2-8? MA, USA)。

流動相：A相為0.1%甲酸水；B相為純甲醇(使用前均超聲除氣20 min)；

洗脱條件：梯度洗脱條件見表；

檢測器：紫外檢測器；

檢測波長：波長320nin；

流速：1.0ml/min；

進樣量：10微升；

柱温：30°C。

獲取大多數次生代謝產物的途徑有兩條，一是由植物自身進行提取，二是利用化學合成法進行合成。植物提取的方法受植物生長的季節及環境限制，提取過程得率低，不易進行大規模的工業化生產；而化學合成方法又存在着成本高、耗能高、易對環境產生污染等缺點。

近年來，利用微生物發酵生產植物次生代謝產物因其成本低、可控性強、無季節限制及環保等優點，愈加受到關注。越來越多的植物次生代謝產物實現了微生物發酵生產。與大多數的次生代謝產物類似，對香豆酸的大規模生產仍依賴於化學合成，收率低且反應耗時長，利用微生物發酵生產對香豆酸將從根本上解決這些問題，為對香豆酸的合成提供一個環保、廉價、可控的選擇。大腸桿菌作為模式菌株的一種，具有清晰的遺傳背景及完整的分子操作技術，一直是代謝途徑構建的首選平台。

由於細菌中尚未發現 CYP450 酶系的存在，若在微生物體內構建對香豆酸的合成途徑，選擇具有酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase，TAL) 活性的酶，催化酪氨酸一步生成對香豆酸是更加直接的合成方法。近年來，陸續有報道利用含有 酪氨酸解氨酶酶活性的微生物生產對香豆酸，如利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)實現對香豆酸發酵等。酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)也被克隆表達於大腸桿菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等模式菌株，實現對香豆酸的生產。由於酪氨酸解氨酶可同時利用苯丙氨酸及酪氨酸為底物，因此需要選擇一種更傾向於利用酪氨酸為底物的 酪氨酸解氨酶，達到直接催化合成對香豆酸的目的。在與其他酪氨酸解氨酶的對比中，來源於 R.glutinis 的 酪氨酸解氨酶具有較高的酶活力，且其 TAL/PAL 活性比係數較高，更傾向於利用酪氨酸為底物生產對香豆酸 ^[3]  。