環介導等温擴增技術

與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、温度循環、電泳及紫外觀察等過程。環介導等温擴增法是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測範圍等指標上能媲美甚至優於PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低於熒光定量PCR。

LAMP法的特徵是針對靶基因上的六個區域設計四條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恆温條件下進行擴增反應，可在15-60分鐘內實現10⁹-10¹⁰倍的擴增，反應能產生大量的擴增產物即焦磷酸鎂白色沉澱，可以通過肉眼觀察白色沉澱的有無來判斷靶基因是否存在。LAMP方法的優勢除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分的簡單，在應用階段對儀器的要求低，一個簡單的恆温裝置就能實現反應，結果檢測也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉澱或者綠色熒光即可，不像普通PCR方法需要進行凝膠電泳觀察結果，是一種適合現場、基層快速檢測的方法。 ^[2] 

擴增原理

LAMP 技術擴增反應的具體過程比較複雜，下文將結合圖2所示，按具體的反應過程對其LAMP原理進行詳解。

在啓動階段，雙鏈DNA 模板在等温（60～65℃）的條件下，內部引物FIP退火，FIP中的F2序列跟模板鏈上Flc位點結合（2），在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下啓動核酸的合成（2），外部引物m也緩慢地退火，與目的序列雜交（3），啓動鏈置換反應，產生一條雙鏈DNA（4），並置換釋放一條單鏈DNA（5）；單鏈DNA一端自動形成環的結構（5），可作為BIP引物的模板， BIP啓動鏈的合成，隨後B3引物退火，同模板鏈雜交（6），引導鏈置換反應產生一條雙鏈DNA（7）和一條兩端成環的單鏈DNA，形成一個啞鈴環的結構（8）；此後，3 端自動引導DNA的合成，快速形成一種莖－環的結構（9），該結構作為LAMP反應中循環反應的起始結構，進入LAMP反應的循環擴增階段。

在循環擴增階段主要是兩個內部引物起作用，引導擴增反應。FIP退火到莖·環結構（9）上，引導鏈置換DNA合成反應，產生結構（10）的產物；隨後產物（10）的3端自動引導鏈置換DNA的合成，生成產物（11）和與開始的產物（8）序列互補的啞鈴環結構（12）；產物（11）和（12）都可做為BIP引物的模板，一個進入延伸循環步驟，形成花椰菜狀的結構（13），另一個重複（8）-（10）的過程，生成產物（14）和（15）；產物（15）再以自身為模板，3’端自動引導鏈置換DNA的合成，生成產物（16）和最初的產物（8），產物（8）開始新一輪的循環擴增，產物（16）進入延伸循環步驟，形成類似（13）花椰菜狀的結構（17）；內部引物又可以產物（13）和（17）作為模板，引導鏈置換DNA的合成，使產物的序列不斷延伸、環化、再延伸，最終的產物是一些具有不同莖長度莖環結構的DNA和帶有許多環的類似花椰菜結構的DNA的混合物。

應用

細菌類病原微生物的檢測，病毒類病原微生物的檢測，真菌類微生物的檢測，現場病原寄生蟲的檢測，轉基因產晶成分檢測

LAMP技術雖然是一種新的核酸擴增技術，但其在分子生物學檢測領域的應用非常廣泛，相對於現有的其他核酸擴增技術，LAMP具有許多獨特的優點：

（1）LAMP技術可以在等温條件下實現擴增，不需要進行模板的預變性，減少了PCR技術升降温帶來的影響以及對昂貴、精密實驗儀器的要求，同時擴增效率高，可以在1 h內把幾拷貝的目的序列迅速擴增到10拷貝；

（2）LAMP技術分別使用一對外部引物和一對內部引物，可以識別目的序列上6個不同的區域，對目的序列具有高度的選擇性，減少了非靶標序列的影響，因此擴增的特異性非常高；

（3）陽性擴增反應中會產生大量的類似花椰菜結構的產物和白色焦磷酸續沉澱，擴增產物的檢測方法多樣，可用凝膠電泳檢測、直接用肉眼檢測或在反應體系中加入染料，根據顏色的變化進行檢測，還可以利用濁度儀，根據擴增產物混濁度的不同對原始核酸分子進行實時定量分析。此外，對於某些病原體可直接利用簡單處理的樣本作為模板，省略繁瑣的DNA/RNA提取步驟。綜上所述，LAMP技術因其快速、高效、特異、靈敏和經濟等優點，已經應用於病原菌、寄生蟲、病毒、疾病和轉基因產品檢測等領域，並且還將廣泛應用於臨牀診斷、環境監測、食源安全等領域，具有更為廣闊的發展應用前景。 ^[3]