X射線晶體學

由於所有的原子都含有電子，並且X射線的波長範圍為0.001－10納米（即0.01－100埃），其波長與成鍵原子之間的距離（1－2埃附近）可比，因此X射線可用於研究各類分子的結構。但是，到目前為止還不能用X射線對單個的分子成像，因為沒有X射線透鏡可以聚焦X射線，而且X射線對單個分子的衍射能力非常弱，無法被探測。而晶體（一般為單晶）中含有數量巨大的方位相同的分子，X射線對這些分子的衍射疊加在一起就能夠產生足以被探測的信號。從這個意義上説，晶體就是一個X射線的信號放大器。X射線晶體學將X射線與晶體學聯繫在一起，從而可以對各類晶體結構進行研究，特別是蛋白質晶體結構。

晶體學可以對很多餘結構相關的問題如整體摺疊、配體或底物結合、作用的原子具體信息提供可靠的答案。運用X射線晶體學 ^[1]  可以瞭解大分子如蛋白質與DNA的結構和功能。分子結構的精確信息是理性藥物設計和基於結構功能研究的先決條件。

①蛋白或DNA樣品純化 ^[2] 

②結晶

③衍射、數據收集

④確定蛋白結構

衍射數據→數據處理→相位解析→建模→模型修正→模型檢驗

⑤理解結構與功能的相互關係

原理：

蛋白質晶體 ^[3]  內部結構為三維空間週期、有序、重複排列，要求每個結晶重複單位(分子或其複合體)的化學組成與分子構象是均一的。

方法：

為了獲得可供衍射的單晶，就需要將純化後的生物樣品進行晶體生長。晶體生長的方法有很多，如氣相擴散法、液相擴散法、温度漸變法、真空昇華法、對流法等等，而目前應用最廣泛的晶體生長方法是氣相擴散法。氣相擴散法又可以分為懸滴法、坐滴法、三明治法、油滴法和微量透析法。其中，懸滴法的使用頻率最高。

（以上方法都屬於化學方法，通常，研究凝聚態物理的用得最多的是區熔法，以多晶材料為基礎通過局部施加高温使其部分熔化後再結晶，從而逐漸得到大塊的晶體，高分子材料通常不能承受過高温度，所以無法使用這種方法）

在獲得初步的晶體生長條件後，往往需要對晶體生長條件進行優化，包括調整沉澱劑濃度、pH值、樣品濃度、温度、離子強度等。

在獲得單晶之後，就需要進行衍射實驗，即用X射線打到晶體上，產生衍射，並記錄衍射數據。X射線的來源主要有兩種，一種是在常用X射線儀上使用的，通過高能電子流轟擊銅靶（或鉬靶），產生多個特徵波長的X射線，其中使用的CuKα的波長為1.5418Å；另一種就是利用同步輻射 ^[4]  所產生的X射線，其波長可以變化。同步輻射X射線可以分為角散同步輻射（ADXD）和能散同步輻射（EDXRD）兩種，角散同步輻射的實驗原理與通常的X射線衍射儀是一樣的，不過波長更低（如0.6199Å），能量更高；而能散使用白光入射，即入射光具有連續波長，收集的衍射信號是在固定角度進行的，它的分辨率較角散同步輻射低，技術要求也較低。現在國內的北京同步輻射實驗站（BSRF）已經升級成了角散的。

衍射數據（包括衍射點的位置和強度）的記錄多采用像板或CCD探測器。

對記錄到的衍射數據進行分析，可以獲得晶體所屬的晶系和對應的布拉維格子以及每個衍射點在倒易空間上的miller指標和對應的強度。

由於晶體衍射實際上是晶體中每個原子的電子密度對X射線的衍射的疊加，衍射數據反映的是電子密度進行傅立葉變換的結果，用結構因子來表示。通過對結構因子進行反傅立葉變換，就可以獲得晶體中電子密度的分佈。而結構因子是與波動方程相關的，計算結構因子需要獲得波動方程中的三個參數，即波的振幅、頻率和相位。振幅可以通過每個衍射點的強度直接計算獲得，頻率也是已知的，但相位無法從衍射數據中直接獲得，因此就產生了晶體結構解析中的“相位問題（phase problem）”。

晶體結構解析中所採用的解決相位問題的方法有直接法和Patterson法。而對於解析生物大分子結構的主要方法有分子置換法、同晶置換法和反常散射法。

把對X射線散射能力大的重金屬原子作為標識原子。這種置換入重原子的大分子應與無重原子時的原晶體有相同的晶胞參數和空間羣，且絕大多數原子的位置相同，故稱同晶置換。從這些含重原子晶體的衍射數據，利用基於派特遜法 ^[6]  的方法可解出重原子的位置，據此算出其結構因子和相角，進而利用相角關係計算出沒有重原子的原晶體的相角，解出結構。經常使用不只一種重原子進行置換，以得幾種同晶置換衍生物, 稱多對同晶置換法。

晶體衍射中有一條弗裏德耳定律, 就是説不論晶體中是否存在對稱中心,在晶體衍射中總存在着對稱中心,也即有FHKL=FHKL。但是當使用的X射線波長與待測樣品中某一元素的吸收邊靠近時,就不遵從上述定律,也即FHKL≠FHKL。這是由電子的反常散射 ^[7]  造成的, 利用這一現象可以解決待測物的相角問題。 一般, 這一方法常與重原子同晶置換法結合使用。在收得同晶置換物的衍射數據後, 改變入射線波長至靠近重原子的吸收邊處，再次收集數據，這套數據是存在反常散射的,可利用這兩套數據來求位相。有如多同晶置換法,如採用幾個不同波長的X射線,對所含不同元素收集幾套反常散射數據,則可得更正確、更完整的相位信息,是為多波長反常衍射法（MAD）。

兩者的相同點：都是利用重原子的特性來解決相角問題。

兩者的差別：MAD是基於MIR的基礎之上的，採用多種波長完備所需的信息。

蛋白質結構 ^[8]  的不同空間尺度分析需要不同的設備