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TILLING技術
鎖定
- 中文名
- TILLING技術
- 外文名
- Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
- 又 稱
- 定向誘導基因組局部突變技術
- 發 展
- Fred Hutchinson癌症研究中心
TILLING技術主要流程
以植物為例，Tilling技術主要流程如下：
1：甲基磺酸乙酯（EMS）誘變種子，誘導產生一系列點突變；
2：將種子培養，獲得第一代突變個體（M1）；
3：M1植株自交，產生第二代植株（M2）；
4：按單株抽提M2植株的DNA，存放於96孔微量滴定板，並保留M2代種子；
5：將多個96孔板的DNA樣本合併到一個96孔板內（最多可合併8個，每塊板相當於768個M2單株）構建DNA池；
6：根據目標基因序列設計一對特異性引物進行PCR擴增，兩個引物分別用700nm和800nm熒光染料標記；
7：PCR擴增片段變性、退火，從而得到野生型和突變型所形成的異源雙鏈核酸分子；
8：用特異性識別並切割錯配鹼基的核酸內切酶CELI酶剪切異源雙鏈核酸分子；
9：酶切產物用變性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝膠電泳分離，然後用標準的圖象處理程序分析電泳圖象，獲得突變池；
10：利用相同方法從突變池中篩選突變個體；
11：突變個體PCR片段測序驗證；
12：突變表型鑑定。
TILLING技術技術特點
A、技術相對簡單
由於TILLING技術是傳統的化學誘變技術與雙色紅外熒光檢測技術的有機相結合，不需要複雜的技術和設備就可以對突變體庫進行大規模篩選，是一種高通量並且相對廉價的技術，提高了篩選效率。
B、可以預測突變頻率，獲得滿意的突變密度使用羣體較小
TILLING技術可以預先估計突變的概率，指導突變體庫的構建。化學誘變技術的突變頻率可以預先估算出來，如EMS主要誘導鹼基從C到T的改變，有實驗證實，發生C/G到T/A的轉變有99%的概率。對這一頻率的計算對於確定目標基因的最佳擴增片段有重要的指導意義。於不同物種、不同受體的誘變頻率有很大差異，對突變頻率的合理估算將增加TILLING的效率。據現有的擬南芥ATP項目的粗略計算，每1Mb約含有4個突變，即每250kb左右含有1個突變，以這一突變密度估算，獲得滿意的突變密度所需的突變體羣體大小小於10000個植株。
C、高通量、自動化操作可以快速獲得鑑定結果
TILLING技術集成了自動加樣設備、高通量的電泳檢測設備，以及優秀的圖象處理和分析系統，容易的實現了自動化操作。擬南芥中TILLING技術己能夠完全自動化。對於有着高突變頻率的羣體（如ATP項目中，每個基因組中含有約1000個突變，即突變頻率約為每1Mb含有7個突變），一天就可以篩選出20個突變，至少可以獲得一個被敲除的基因突變和超過12個以上的一系列錯義突變。如果用標準的自動加樣器結合自動化手臂的操作替代手工操作，有望把篩選量增加到每天16輪，這樣每天就可以鑑定3到4個基因。由此可見，TILLING技術適應了大規模高通量的篩選要求。
