RNA原位雜交

原位雜交早在1969年開始使用，並於1981年開始用於RNA 的原位雜交檢測[1, 2] ^[1]  。

但一直以來，由於缺乏敏感性和特異性，RNA原位雜交一直受到較大的限制。科學家們一直在致力於改進RNA原位雜交。

使用放射性標記的RNA探針進行的。Isoptopic ISH 可以達到高敏感性，但是需要很長的曝光時間（數天到數週），同時只提供有限的形態學數據。該種雜交方法由於使用的探針很長，曝光時間也很長，所以存在非特異性雜交以及長時間曝光導致與高背景干擾信號產生。由於以上問題以及放射性污染，從而限制了此項技術的普遍應用。

熒光標記或者生物素寡核苷酸探針的應用極大程度地促進了RNA原位雜交的應用，該方法縮短了實驗時間，同時達到了放射性探針的雜交敏感性。這類探針可以在雜交後通過熒光或者可見光酶促反應成像。作為一種DNA探針的替代物，RNA探針使用ribo探針，該探針可以通過體外轉錄產生，通常有幾百個鹼基。與DNA寡核苷酸探針相比，ribo探針可以和目標RNA形成更加穩定的雜交，從而允許使用高強度的洗脱條件來增加非特異性。但是，由於RNA的天然特性，使得該類探針的標記物位點有限，由於存在非特異性結合導致較高的非特異性雜交，導致DNA 寡核苷酸探針與RNA riboprobes 探針的信噪比無法有效控制。另外，在檢測靈敏度上也有一定侷限。對於低水平表達或者部分降解的RNA，不能做到很好的檢測。

直接檢測RNA 原位雜交方法，例如市場上Biosearch 公司（Stellaris ™ , Biosearch TechnologiesPetaluma, CA）使用直接熒光標記的小的單鏈寡核苷酸探針。多個探針設計針對每個目標RNA，每個與一小段序列互補，它們結合延伸至整個序列的長度。以這種方式，使用多個探針可以確保提高靈敏度，並且在不可避免的一個或兩個探針非特異性雜交背景下熒光信號足以觀測到。由於直接檢測標記的探針，這項技術是簡單而快速的。然而，該技術的靈敏度和信噪比仍然很侷限，需要專門的去背景算法進行結果分析。

RNAscope®專利技術是近年來最火的RNA原位雜交技術，是RNA原位雜交（ISH）領域的一項重大進步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）開發，通過專利的雙“Z”探針設計和信號放大系統，使RNA原位雜交具有高度特異性、單分子檢測的敏感性並有極高的信噪比，能夠在單細胞水平同時定量多個RNA的表達，在獲得單細胞中單拷貝RNA表達數據的同時提供完整的組織形態學信息[3] ^[2]  。

RNAscope 方法克服了以前的RNA原位雜交技術的非特異性雜交、靈敏度低、對樣本要求高等弱點，可替代傳統的ISH/FISH RNA 原位檢測，同時單分子檢測靈敏度提供了在組織細胞原位對單個細胞中基因的表達進行檢測，釋放RNA作為生物標記的全部潛能，提高對疾病與標誌物之間複雜的生物學相關性的認識，是理想的能夠用於NGS和芯片技術後期轉化研究技術平台。

RNAscope®原位雜交是一項新穎的用於檢測位於組織細胞原位的目標RNA的原位雜交（In Situ Hybridization，ISH）檢測技術。該技術進行RNA原位雜交檢測主要分成5步。

Step 1：透化：通過RNAscope®預處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細胞，暴露目標RNA。

Step 2：探針雜交：針對靶基因設計RNAscope®專利Z型探針與目標RNA雜交。

Step 3：信號放大：RNAscope®檢測試劑盒逐級信號放大。

Step 4：信號可視化：在普通光學顯微鏡或者多光譜熒光成像系統下，每一個目標RNA分子以一個點狀信號的形式呈現。

Step 5：量化分析：顯微鏡下直接計數或者使用圖像分析軟件如RNAscope® SpotStudio™ 或HALO對每一個細胞中的RNA單分子信號進行精確定量分析。