PCR擴增儀

1971年，Dr. Kjell Kleppe首次在Journal of molecular biology期刊發表的文章中準確、客觀地闡述了PCR方法。

1985年，美國PE-Cetus公司的Kary Mullis等人發明PCR技術。它推動了現代醫學由細胞水平向分子水平、基因水平發展，是DNA測序的基礎，它成為現代分子生物學發展過程中的一座里程碑。Mullis等也因此獲得了1993年的諾貝爾獎。

PCR擴增儀通常由熱蓋部件、熱循環部件、傳動部件、控制部件和電源部件等部分組成 ^[1]  。

PCR技術的原理類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成 ^[2]  。

模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

模板DNA經加熱變性成單鏈後，温度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補序列配對結合。

DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈。

重複循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一輪循環需2~4分鐘，如此反覆進行，每一輪循環所產生的DNA均能成為下一輪循環的模板，每一輪循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增1倍，PCR產物以2的指數形式迅速擴增，經過25~30輪循環後(2~3小時)，理論上可使基因擴增10⁹倍以上，實際上一般可達10⁶~10⁷倍。

PCR的三個反應步驟反覆進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA擴增量可用y=(1+X)ⁿ計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，實際反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨着PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，使平均效率達不到理論值 ^[2]  。

參加PCR反應的物質為模板、引物、耐熱DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸和鎂離子，其中關鍵步驟是最佳引物的設計 ^[2]  。

模板(靶基因或樣品DNA)核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環節之一。一般臨牀檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因遊離，直接用於PCR擴增。DNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解RNA。

PCR產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈作引物。每條引物鏈的濃度為0.1~1μmol或10-100pmol，以反應所需要的最低引物量的濃度為好。

TaqDNA聚合酶基因全長2496個鹼基，75~80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷酸，在PCR循環的高温條件下仍能保持較高的活性和良好的熱穩定性，温度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性。目前，有兩種TaqDNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。

dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關係。在PCR反應中，dNTP應為50-200μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配製)，濃度過低又會降低PCR產物的產量。

Mg²⁺能與dNTP結合，Mg²⁺對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為20μmol/L時，Mg²⁺濃度為1.5~2.0mmol/L為宜，Mg²⁺濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增：濃度過低，會降低taqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件為温度、時間和循環次數。

1. 温度與時間的設置：基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸3個温度點。在標準反應中，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40~60℃，引物退火併結合到靶序列上，然後快速升温至70~75℃，在 TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。

2. PCR反應時間：變性時間一般2~3min，可以使模板DNA完全變性。復性時間一般為30~60s，足以使引物與模板之間完全結合。PCR延伸反應的時間可根據待擴增片段的長度而定，一般1kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。

3. 循環次數：循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30-40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多

根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

1. 普通PCR儀

一次PCR擴增只能運行一個特定退火温度的PCR儀稱作傳統PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火温度需要多次運行。主要是用於簡單的、對目的基因退火温度的擴增。該儀器主要應用於科學研究、教學、醫學臨牀、檢驗檢疫等機構。

2. 梯度PCR儀

一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火温度條件（温度梯度，通常有12種温度梯度）的PCR儀稱作梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其最適退火温度是不同的，通過設置一系列的梯度退火温度進行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的最適退火温度，進行有效的擴增。用於研究未知DNA退火温度的擴增，這樣節約成本的同時也節約了時間。梯度PCR儀在不設置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。主要應用於科研、教學機構。

3. 原位PCR儀

用於從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀稱作原位PCR儀。如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在位置上進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA，又能標出靶序列在細胞內的位置，對於在分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨牀過程及病理的轉變有重大的實用價值。主要應用於臨牀、科研。

4. 實時熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎上增加一個熒光信號採集系統和計算機分析處理系統的PCR儀稱作熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號採集系統實時採集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出。把這種PCR儀叫做實時熒光定量PCR儀（qPCR儀）。熒光定量PCR儀有單通道、雙通道和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同目的基因片段的量。主要用於醫學臨牀檢測、生物醫藥研發、食品行業、科研院校等機構。

根據DNA擴增時升温介質的不同可以將PCR儀分為：變温鋁塊式PCR儀、水浴式PCR儀和變温式流式PCR儀。

1. 變温鋁塊式PCR儀

熱源用電阻絲、導電熱膜、熱泵式珀爾帖半導體元件製作，讓帶有凹孔的鋁塊升温，用自來水、製冷壓縮機或半導體降温。優點：温度傳導快，各管的擴增一致性好；反應管規格一致時無須外塗石蠟油；可用微電腦調節温度轉換；儀器製冷部件可以在完成擴增後降温至4℃，保存樣品過夜。缺點：管內反應液温度比鋁塊顯示温度滯後；須使用特製且與鋁塊凹孔形狀緊密吻合的薄壁耐熱反應管；變温時難以快速克服鋁塊的熱容量；壓縮機制冷啓動慢、重量大、滯後時間長。

2. 水浴式PCR儀

儀器本身有3個不同温度的水浴，用機械裝置將帶有反應管的架子移位和升降温度，使温度循環。優點：水為傳熱介質，温度易恆定，熱容量大；反應管形狀無特殊要求，温度轉換較快擴增效果穩定；具有較高的運行效率，擴增產物特異性好。缺點：高温浴不穩定，水面需用液體石蠟覆蓋；改變水浴温度所需時間較長，不易實施複雜程序（如套式PCR）的操作，儀器體積較大；室温影響温度下限。

3. 變温式流式PCR儀

依據空氣流的動力學原理，以冷熱氣流為介質升降温度。優點：變温迅速，擴增效果好，適合於微量、快速PCR；反應器不受形狀限制，管外無需塗液體石蠟；測定管內液體温度作為控温依據，顯示温度真實可靠；易於用微電腦設定複雜的變温程序；易於製成重量較輕的便攜式儀器，適合外出作業。缺點：以室温為温度下限，低温難控制，對空氣流的動力學要求較高，需精心設計才能使各管温度均勻。

環境温度：5℃～40℃；相對濕度：不大於80%；環境清潔少塵，避免陽光直射；遠離熱源、水源、強烈的電磁干擾源。

選擇較為堅實的、不怕濕的枱面安置儀器，枱面高度適中，輕鬆操作。儀器四周留取一定空間，間隔20cm以上，用於通風和散熱。供電線路需承受10A電流。提供良好接地將進一步提高電氣安全性和系統可靠性。