複製鏈接
請複製以下鏈接發送給好友

乳酸脱氫酶

鎖定
乳酸脱氫酶(lactate dehydrogenase,LD [1]  或LDH [2]  ,EC1.1.1.27 [2]  )是一類NAD依賴性激酶,有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基,可構成6種四聚體同工酶。 [3]  動物乳酸脱氫酶是由4個亞單位組成的四聚體,常見的A、B兩種亞基構成的5種LDH同工酶(LDH1-5),C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。 [3] 
乳酸脱氫酶為含鋅離子的金屬蛋白,分子量為135-140kD,是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一,可催化丙酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應,也可催化相關的α-酮酸。LDH廣泛存在於人體組織中,以腎臟含量最高,其次是心肌骨肌紅細胞內LDH約為正常血清的100倍。 [4] 
中文名
乳酸脱氫酶 [1] 
外文名
Lactate dehydrogenase [2] 
性    質
氧化還原酶 [2] 
簡    稱
LD或LDH [2] 
作    用
糖酵解酶之一 [1] 
亞    基
LDHA、LDHB、LDHC [3] 

乳酸脱氫酶分類介紹

根據結合輔酶的不同,微生物體一般包含兩種乳酸脱氫酶,NAD-依賴型乳酸脱氫酶(NAD-dependent lactate dehydrogenases,nLDHs)和NAD-非依賴型乳酸脱氫酶(NAD-independent lactate dehydrogenases,iLDHs)兩大類。NAD-非依賴型乳酸脱氫酶,也被稱作呼吸鏈乳酸脱氫酶,在微生物體內通常被認為是負責乳酸氧化的酶類。它們編碼的基因與乳酸利用相關的乳酸透性酶和調節蛋白編碼的基因較近。相較於NAD-非依賴型乳酸脱氫酶,NAD-依賴型乳酸脱氫酶分佈範圍更廣泛,在人體、動物以及微生物中都普遍存在。在微生物中,NAD-依賴型乳酸脱氫酶存在於其細胞質中,體外實驗證實:NAD-依賴型乳酸脱氫酶能夠以NADH為輔因子催化丙酮酸還原生成乳酸,並且氧化NADH為NAD+,同時該酶在特定的條件下可以催化逆反應的進行,但是活力非常弱,不容易檢測。一般説來,與NAD-依賴型乳酸脱氫酶以NADH為輔因子不同的是NAD-非依賴型乳酸脱氫酶主要利用黃素。NAD-依賴型乳酸脱氫酶也可以在體內催化乳酸的氧化,但體外實驗可能需要較高的pH和底物濃度。 [5] 
乳酸脱氫酶 乳酸脱氫酶
按其催化底物的構型不同,NAD-依賴型乳酸脱氫酶可以分為NAD依賴型-L-乳酸脱氫酶(L-NAD-依賴型乳酸脱氫酶)和NAD依賴型-D-乳酸脱氫酶(D-NAD-依賴型乳酸脱氫酶)兩大類,分別催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。研究表明,雖然L-NAD-依賴型乳酸脱氫酶和D-NAD-依賴型乳酸脱氫酶均催化丙酮酸合成乳酸,但二者的基因序列不具有相似性或一致性。已知的不同乳桿菌的D-NAD-依賴型乳酸脱氫酶之間存在40%~50%的氨基酸同源性,而D-NAD-依賴型乳酸脱氫酶和L-NAD-依賴型乳酸脱氫酶之間則只存在10%左右的同源性,表明兩種脱氫酶分別由兩個完全不相關的家族進化而來。不僅如此,酶之間的差異也表現在動力學參數差異明顯,比如,兩者催化反應的反應常數kcat和米氏常數Km不同。 [5] 
根據天然電子受體的不同,可以將NAD-非依賴型乳酸脱氫酶分為三類。第一類為膜蛋白,利用膜醌類作為外部的電子受體;第二類直接利用O2作為電子受體,根據氧化終產物的不同,又將其細分為乳酸氧化酶(Lactate oxidase,LOX)和乳酸單氧酶(Lactate monooxygenases,LMO),其中前者產生丙酮酸和H2O2,而後者產生乙酸、CO2和H2O;第三類是硫胺b2(flavocytochrome b2),存在於真菌中,它天然的電子受體為細胞色素c。大多數L-NAD-非依賴型乳酸脱氫酶屬於α-羥酸氧化黃素蛋白家族,利用還原型黃素單核苷酸(Flavin mononuleotide,FMN),而所有的D-NAD-非依賴型乳酸脱氫酶均可利用黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為電子受體,而不是FMN,它們具有FAD結合的氧化還原酶/轉移酶4的家族特徵。此外,D-NAD-非依賴型乳酸脱氫酶還可以利用醌類或細胞色素c作為電子受體,但是迄今為止,還沒有D-NAD-非依賴型乳酸脱氫酶直接利用O2的相關報道。Wolin的研究表明,一些鏈球菌LDHs的催化活性絕對依賴於果糖-1,6-二磷酸(Fructose-1,6-Diphosphate,FDP)。其他鏈球菌、雙歧桿菌屬的所有種、乾酪乳桿菌和木糖乳桿菌等都發現了相似的NAD-非依賴型乳酸脱氫酶。 [5] 

乳酸脱氫酶結構功能

研究表明,L-乳酸脱氫酶(L-LDH)和L-蘋果酸脱氫酶屬於同一家族,而D-乳酸脱氫酶(D-LDH)屬於D-2-羥酸脱氫酶家族。 [5] 
D-乳酸脱氫酶
大多數D-乳酸脱氫酶催化是可逆反應,極少數不可逆;對於可逆的D-乳酸脱氫酶來説,只有環境中乳酸濃度較高時才催化逆反應,即催化乳酸合成丙酮酸,來參與細菌的代謝。 [5] 
D-乳酸脱氫酶的一級結構比對錶明,不同種屬的D-乳酸脱氫酶的氨基酸序列存在較大的差異,但是參與丙酮酸的結合與催化的氨基酸殘基卻十分保守。Kochhar等的研究顯示L.bulgaricus的D-乳酸脱氫酶是一個由相同亞基組成的二聚體,每個亞基由332個氨基酸殘基組成,分子量為36.8 ku,經化學修飾發現位於催化中心的三個組氨酸(His205、His296和His303)和Asp259對底物的催化具有十分重要的作用。Kochhar等還發現,His289也參與了底物結合,但His289不是D-2-羥基酸脱氫酶家族中保守的氨基酸殘基。另外,通過對Cys殘基的化學修飾發現Cys234可能參與底物結合和催化作用,這在L.helveticus的羥基丙酮酸還原酶中也能得以證實。研究還發現L.helveticus CNRZ32 的D-乳酸脱氫酶氨基酸序列和D-2-羥基酸脱氫酶家族的D-3-磷酸甘油酸脱氫酶、羥基丙酮酸還原酶和D-2-羥基己酸脱氫酶存在很高的同源性,這也暗示了該酶是D-2-羥基酸脱氫酶家族的一個成員。Razeto等對L.bulgaricus的D-乳酸脱氫酶構象進行了研究,結果發現L. bulgaricus的D-乳酸脱氫酶是一個由兩個相同的亞基構成的不對稱酶,A亞基的酶蛋白是典型的“開放”構象,而B亞基是典型的“閉合”構象。其中NADH的結合位點主要存在於B亞基中,而在A亞基中僅有30%,同時在底物結合口袋中有一個硫酸根離子。另外,該研究還建立了丙酮酸分子在活性位點的模型。在閉合域中,存在一簇疏水的氨基酸殘基緊緊圍繞着丙酮酸分子的甲基,在這個疏水氨基酸簇中至少有三個氨基酸殘基(Tyr52、Phe299和Trp135’)決定底物的專一性。研究表明該底物結合位點有利於閉合域的穩定和酶的激活。 [5] 
L-乳酸脱氫酶
大多數乳酸菌中不僅存在D-乳酸脱氫酶也存在L-乳酸脱氫酶,L-乳酸脱氫酶催化丙酮酸還原生成L-乳酸。L-乳酸脱氫酶分為兩型:一類可被FDP激活,屬於別構酶;另一類不需要FDP激活,不具有別構效應。據Hiroyuki Uchikoba報道,L.pentosus的L-乳酸脱氫酶是一個非異構酶,但是它的氨基酸序列和一些細菌的別構LDH具有很高的相似性。該酶的四聚體由相同亞基組成對稱的酶結構。它的活性構象和別構LDH的構象相似。 [5] 
Kazuhito Arai等的研究表明,Lactobacillus的L-乳酸脱氫酶氨基酸序列中,Glu102、Asp197和Thr246是高度保守的,它們參與了底物的識別;另外,98-110氨基酸殘基構成了活性位點環,它們參與催化反應。Arg171的胍基和丙酮酸的羰基形成雙氫鍵,從而使丙酮酸在催化位點中處於正確的結合方向。研究表明,在L-乳酸脱氫酶的氨基酸序列中同樣存在一個與輔酶NADH結合的結構域Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-(17Xaa)-Asp,其中該結構域中的Asp決定了L-乳酸脱氫酶的輔酶是NADH,而不是NADPH4]。L.pentosus中L-乳酸脱氫酶的活性位點和其他LDH相似,包括了參與催化與底物結合的保守氨基酸殘基,如Aspl68、Argl71和Hisl955。其中,Argl71在底物的結合中起着重要作用;另外,Hisl95主要在催化過程中作為質子供體和受體。值得注意的是,雖然Bacillus 和Lactobacillus的L-乳酸脱氫酶在進化關係上存在很近的親緣關係,但是活性位點環的氨基酸殘基也存在差異,如101位Bacillus是Asn,而Lactobacillus是Pro。這表明L-乳酸脱氫酶是否來自好氧或厭氧的革蘭氏陽性菌可以由這個位置的氨基酸殘基是Asn101還是Pro101來識別。 [5] 

乳酸脱氫酶生理生化

半壽期:10-160h。 [4] 
穩定性:與温度有很大關係,不管在什麼温度下保存均可導致酶失活。 [4] 

乳酸脱氫酶分離純化

從微生物中分離純化乳酸脱氫酶的步驟主要包括細胞壁破碎、粗酶液的製備(包括離心、鹽析等)、酶的分離純化等。由於柱層析法分辨率較高,在乳酸脱氫酶分離純化中較常使用。 [2] 

乳酸脱氫酶測定方法

乳酸脱氫酶原理

乳酸脱氫酶催化乳酸至丙酮酸之間的可逆性反應,目前正反兩個方向的反應均能測定,由於逆反應的速度比正反應快4倍,測得的活性也高得多,因此採用不同反應方式的試劑盒得出的結果也不相同。 [6] 
1994年IFCC推薦的參考方法為從乳酸至丙酮的正反應。 [6] 
L-乳酸+氧化型輔酶Ⅰ→丙酮酸+還原型輔酶 [1] 

乳酸脱氫酶參考值

乳酸脱氫酶化驗單 乳酸脱氫酶化驗單
血清:35-88U/L(pH8.8-9.0 ,30°C); 100-225U/L(pH8.8-9.0,37°C)。 [6] 
尿:42-98U/L(pH8.8-9.0,25°C,連續監測LD-L法)。 [6] 
血清:200-380U/L(連續監測LD-P法)。 [6] 
血清:95-200U/L(pH7.4 ,30°C ;200-380U/L(pH7.4,37°C)。 [6] 
腦脊液:7-30U/L(pH7.4,30°C ,比色法)。 [6] 

乳酸脱氫酶臨牀意義

乳酸脱氫酶升高常見於: [1] 
(1)心肌梗死:心肌梗死後9-20h開始上升,36-60h達到高峯,持續6-10天恢復正常,因此可作為急性心肌梗死後期的輔助診斷指標。 [1] 
(2)肝臟疾病:急性肝炎、慢性活動性肝炎、肝癌、肝硬化、阻塞性黃疸等。 [1] 
(3)血液病:如白血病、貧血、惡性淋巴瘤等。 [1] 
(4)骨骼肌損傷、進行性肌萎縮、肺梗死等。 [1] 
(5)惡性腫瘤轉移所致胸、腹水中乳酸脱氫酶活力往往升高。 [1] 
乳酸脱氫酶降低無意義。 [6] 

乳酸脱氫酶注意事項

由於紅細胞內LDH活性比正常血清中LDH活性高1000倍,溶血時血清LDH活性顯著增高,故送檢標本不能溶血。由於草酸鹽抑制LDH,故測LDH活性,宜採用血清而不採用血漿。另外,若血清中未除盡血塊,無論在4℃還是室温存放標本,LDH活性都將明顯增高。 [6] 

乳酸脱氫酶主要作用

乳酸脱氫酶是微生物中催化苯丙酮酸生成苯乳酸(phenyllactic acid,PLA,C9H10O3,也稱2-羥基-3-苯基丙酸)的一類關鍵酶。乳酸脱氫酶是生物體內糖酵解途徑中一種至關重要的氧化還原酶 [2]  ,能可逆地催化乳酸氧化為丙酮酸,該催化反應是無氧糖酵解的最終產物。 [6]  乳酸脱氫酶主要存在於心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等動物組織中。 [2]  乳酸脱氫酶測定常用於診斷心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤。 [1] 

乳酸脱氫酶同工酶

乳酸脱氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是一類NAD依賴性激酶,有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基,可構成6種四聚體同工酶。 [3]  動物乳酸脱氫酶是由4個亞單位組成的四聚體 [2]  ,是一個具有5種同工酶形態的分子 [2]  ,即常見的A、B兩種亞基構成的5種LDH同工酶(LDH1~5) [3]  。C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。 [3]  用電泳的方法可以將人和動物組織的LDH分離出5種LDH同工酶。 [4] 
人血清中含有5種同工酶 [1]  ,按其組織來源來説,LD1和LD2主要來源於心肌,臨牀常用的α-羧基丁酸脱氫酶(α-HBD)實際上就是LD1和LD2的活性之和;LD3主要來源於肺、脾;LD4和LD5(特別是LD5)主要來源於肝和骨骼肌。 [4]  正常人血清中LD同工酶活性大小順序為:LD2>LD,>LD4>LD3,不少疾患不僅有LD總活性變化,而且由於病變的臟器不同,各個同工酶變化也不一致。 [1] 

乳酸脱氫酶正常參考值

瓊脂糖電泳法:
LDH1(28.4±5.3)%;
LDH2(41.0±5.0)%;
LDH3(19.0±4.0)%;
LDH4(6.6±3.5)%;
LDH5(4.6±3.0)%。
醋酸纖維素薄膜法:
LDH1(25.32±2.62)%
LDH2(34.36±1.57)%
LDH3(21.86±1.38)%
LDH4(11.3±1.84)%
LDH5(7.97±1.59)%
聚丙烯酰胺法:
LDH1(26.9±0.4)%
LDH2(36.0±0.5)%
LDH3(21.9±0.4)%
LDH4(11.1±0.4)%
LDH5(4.1±0.3)%
健康成人血清LDH同工酶有如下的規律:LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5。 

乳酸脱氫酶臨牀意義

心肌細胞LD活性遠高於血清數百倍,尤以LDH1和LDH2含量最高。急性心肌梗塞時,血清LDH1和LDH2顯著升高,約95%的病例的血清LDH1和LDH2比值大於1,且LDH1升高早於LDH總活性升高。病毒性和風濕性心肌炎及克山病心肌損害等,病人的血清LDH同工酶的改變與心肌梗塞相似。LDH1/LDH2比值>1還見於溶血性貧血、惡性貧血、鐮形細胞性貧血、腎臟損傷、腎皮質梗塞、心肌損傷性疾病、瓣膜病等。
腦幹含LDH1較高。頗腦損傷僅累及大腦半球時,只有血清同工酶譜的絕對值增高,而不影響同工酶的相互比值,如果累及腦幹時,病人血清LDH1的含量也增高。
急性心肌梗塞發病後12~24小時,血清LDH1業已升高。若同時測定LD總活性,可發現LDH1/總LDH的比值對急性心肌梗塞診斷的陽性率與可靠性優於單純測定LDH1或CK-MB。
胚胎細胞瘤病人的血清LDH1活性升高。
肝細胞損傷或壞死後,向血流釋入大量的LDH4和LDH5,致使血中LDH5/LDH4比值升高,故LDH5/LDH4>1可做為肝細胞損傷的指標。急性肝炎以LDH5明顯升高,LDH4不增,LDH5/LDH4>1為特徵;若血清LDH5持續升高或下降後再度升高,則可認為是慢性肝炎;肝昏迷病人的血清LDH5、LDH4活性極高時,常示預後不良;原發性肝癌以血清LDH4>LDH5較為常見。
腎皮質以LDH1和LDH2含量較高,腎髓質以LDH4和LDH5活性較強。患急性腎小管壞死、慢性腎盂腎炎、慢性腎小球腎炎以及腎移植排異時,血清LDH5均可增高。
肺含LDH3較多,肺部疾患時血清LDH3常可升高。肺梗塞時LDH3和LDH4相等,LDH1明顯下降;肺膿腫病人的血清LDH3、LDH4常與LDH5同時升高。
血清LD總活性升高而同工酶譜正常(LDH1/LDH2<1)的病例,臨牀出現率依次為;心肺疾病、惡性腫瘤、骨折、中樞神經系統疾患、炎症、肝硬變、傳染性單核細胞增多症、甲狀腺機能低下、尿毒症、組織壞死、病毒血症、腸梗阻等。
肌營養不良病人肌肉中LDH1、LDH2明顯增高,LDH5顯著下降;而血清則相反,LDH1、LDH2明顯減少,LDH4、LDH5顯著,表明血清LDH同工酶主要來自肌肉組織。煤礦、鎢礦矽肺病人的血清LDH1、LDH2下降,LDH4、LDH5升高。
(4)惡性病變時LDH3常增高。
參考資料