HPO

高等哺乳動物組織再生能力非常有限。肝臟是機體最重要的器官之一，至少承擔着5000種以上的生理功能，最具吸引力的是其損傷後驚人的組織修復即肝再生能力。有關肝再生調控的研究已有半個多世紀的歷史，1931年Higgins 和Anderson首先全面描述大鼠肝部分切除（Partial　Hepatectomy,PH）後再生過程，隨着原代肝細胞培養技術的建立和分子生物學技術的發展，對肝再生受內分泌，旁分泌及自分泌的信號調控機理的研究已取得令人矚目的進展。

人們已經認識到：

⑴肝再生早期基因的激活由升高於閾值的循環生長因子啓動；

⑵肝部分切除後即刻出現的快速代謝適應使肝細胞對肝內外生長因子產生反應，並使大量反應性基因激活。大量事實證明，生長因子在肝再生啓動及其進程中發揮着舉足輕重的作用。近年來人們逐漸集中於尋找具有肝組織特異作用的生長因子，進而發現並克隆了血源性肝細胞生長因子（HGF）。

但隨後的研究表明，HGF作用的靶細胞非常廣泛，而並非如人們最初想象的那樣——特異作用於肝臟細胞，專一性地促進肝細胞再生。而真正支持肝細胞完成其再生過程的是一種來源於肝臟自身、特異性刺激肝細胞增殖的小分子物質，即肝刺激物（Hepatic stimulatory substance，HSS），或稱胞源性肝細胞生長因子（Cytosolic HGF，HGF-c）/肝再生增強因子（Augmentor of liver regeneration，ALR）/肝細胞生成素（Hepatopoietin，HPO）。

早在七十年代LaBrecque等即報道在哺乳動物再生肝中存在一種特異促肝增殖的細胞活性因子HSS，隨後研究表明該因子廣泛存在於哺乳動物幼仔肝、胚胎肝及再生肝組織中。HSS分子量為15～20kD的蛋白質，具有熱穩定性和器官特異性，在體內外均具有刺激肝源細胞DNA合成的作用。

從1989年起，中國學者開始了對胎肝細胞有效成份的分離和純化，

中國賀福初實驗室從80年代始，先後在國內外首次系統地闡明h-FLCS治療肝衰竭的有效成分；發現第一種特異刺激肝細胞增殖與肝臟再生的hHPO；完成其蛋白質分離純化與鑑定及其抗體的製備；證明HPO為基因表達產物並構建表達型人胎肝cDNA文庫；在國際上首次公開報道hHPO的分子克隆和重組hHPO的研製，並完成其重組品理化性質鑑定；揭示天然及重組hHPO均具有救治肝功能衰竭的作用。

肝炎、肝硬化在中國中普遍發病率高、危害嚴重。尤其是急性肝功能衰竭，有起病急、預後差、病死率高的特點，其預後主要取決於病損肝細胞的壞死程度和再生能力。肝臟是為數不多能夠再生的哺乳動物器官，其在受到物理、化學損傷後能夠再生，利用肝再生的特性，緩解病毒對肝的損害是肝再生研究的熱點之一，因此，預防肝壞死與促進肝再生已成為臨牀肝損傷各種治療的出發點。以往臨牀上的治療措施雖有助於清除體內有毒物質，但無助於刺激病損肝臟的再生，從肝臟本身尋求治療嚴重肝病的有效物質一直是人們夢寐以求的願望。

它如何發揮其生物學效應，其作用分子機理如何，其信號轉導途徑（包括受體，信號轉導途徑及其所激活的轉錄因子）的研究是問題的關鍵，它是否與其它肝再生相關生長因子一樣，通過特異的肝細胞受體（膜受體和核受體）介導而發揮其生物學效應的，我們開展了這方面的研究。

本文首次利用基因工程產品rhHPO,以多種細胞係為靶細胞，對rhHPO體外的生物學活性進行較全面的研究。

材料和方法

一、材料

二、方法

⒈ 大鼠肝細胞和人胎肝細胞的分離和培養

⒉細胞株的分離和培養

3．細胞增殖檢測

⑴MTS法

⑵3H-RdR摻入法

體外原代肝細胞培養體系（無血清）中，rhHPO可刺激原代大鼠肝細胞、胎肝細胞的增殖（p＜0.01），並呈正向相關；16～24ng/ml劑量時，刺激增殖效應趨於飽和。在24ng/ml劑量時，原代大鼠肝細胞OD492值可增加1.67倍，人胎肝細胞OD492值可增加2.35倍。

rhHPO在體外劑量為24ng/ml時Smmc7721 DNA合成可增加2.11倍，HepG2可增加7.5倍，HTC可增加4.66倍，具有很明顯的促肝癌細胞增殖的作用。並具有劑量效應正相關，其中以對HepG2細胞的刺激效果最好，16～24ng/ml劑量時，刺激增殖效應趨於飽和。

為了進一步探究肝臟與肝臟以外的器官對rhHPO的反應性，我們選取了一些造血細胞系，喉癌細胞系及肺癌細胞系作進行了對比。結果發現rhHPO對所選取的這些細胞均無刺激作用，但對GLC-82細胞有較為明顯的抑制作用，且具有明顯劑量效應負相關，但pHGF無此刺激作用。

我們在完成人HPOcDNA克隆、原核表達、鑑定、及純化，得到純品rhHPO基礎上，進而對其體外的生物學活性進行研究，與國外大鼠ALR生物學活性研究結果不同，rhHPO不僅可促原代培養大鼠肝細胞和人胎肝細胞的增殖，而且對肝源性肝癌細胞繫有促DNA合成的作用，但對非肝源性細胞無刺激增殖作用，説明HPO生物學功能具有一定的組織細胞特異性，為認識HPO的作用機理提供了新的思路。另外觀察到HPO對肺癌細胞系GLC-82具有抑制其DNA合成的作用，為探究其新的生物活性提供了有益的提示。

HPO特異性地顯著刺激肝源性細胞DNA的合成，這種直接刺激作用可能是HPO促肝細胞增殖的重要機理，説明HPO是一種與肝再生密切相關的生長因子，它的體外活性的確立，對進一步研究和開發HPO具有不可忽視的作用，對於闡明肝再生分子生物學機理，臨牀上尋找真正的特異性支持肝再生的治療藥物都具有重大的意義。

我們採用的是氯胺-T法經典的標記方法。125I- rhHPO與rhHPO是否具有一樣的理化性質，是進行受體結合同位素示蹤的基礎本實驗以肝癌細胞HepG2為對象，採用3H-RdR摻入法測定125I- rhHPO的生物學活性，同時利用SDS-PAGE，結合放射自顯影的方法，對已標記的 rhHPO進行理化性質的鑑定。

材料與方法

一、材料

二、方法

⒈標記過程

⒉標記蛋白質的分離及純化

⒊標記率的測定

⒋125I-rhHPO的保存

⒌125I- rhHPO生物學活性測定

⒍125I-rhHPO的蛋白電泳⑷

125I-rhHPO與遊離碘（125I）分離效果較好。

125I-rhHPO於SDS-PAGE電泳顯示單一條帶，分子量與未標記rhHPO的一致。標記後的125I-rhHPO仍然保持與未標記rhHPO一樣的生物學活性。

放射性受體配基競爭結合實驗是研究受體特性的經典方法，獲得高標記低失活的配基是實驗成功的前提。標記的好壞直接影響受體配基結合的分析結果，標記後的配基放射活性太高，預示着配基分子結構的破壞和生物學活性的喪失，標記放射活性太低，易造成假陰性。標記的125I-hHPO放射活性在75～100mCi/mg之間。

以3H-TdR摻入法測定125I- rhHPO的生物學活性，可以監測標記後HPO失活的狀態，選擇具有高標記低失活的125I-rhHPO進行受體結合競爭實驗，才能達到同位素示蹤的目的。

利用SDS-PAGE分離蛋白質主要取決於蛋白質分子量大小的原理，對125I- rhHPO和未標記的rhHPO進行蛋白電泳，可以初步判斷是否存在125I- rhHPO理化性質的改變，綜合篩選適合進行放射配基結合分析實驗的配基，為進行HPO受體的確立及特性研究打下良好的基礎。

有關HPO發揮作用的具體機理尚不清楚，是否與其它肝再生相關多肽生長因子一樣存在膜受體以及是否通過受體介導而發揮生物學效應，國內外未見任何報道。放射配基結合分析法是研究受體特性的經典方法，因此我們利用前面具有高活性低失活已碘標記的HPO，通過受體配基結合競爭實驗，首次證實HPO膜受體的存在，並對HPO受體的特性進行初步的研究。

材料與方法

一、材料

二、方法

1．大鼠原代肝細胞、人胎肝細胞和細胞株的分離及培養

2．125I-HPO受體結合實驗

3．125I-rhHPO與膜受體親和力的交聯反應

4．HepG2上HPO受體的放射自顯影

通過受體結合實驗和結合競爭抑制實驗發現，肝源性細胞包括正常肝細胞（如原代培養大鼠肝細胞、人胎肝細胞和L02細胞等）與非正常肝細胞（如HepG2、HTC和SMMC7721肝癌細胞等）與125I-rhHPO反應具有劑量效應關係，以原代培養大鼠肝細胞、人胎肝細胞和HepG2細胞為代表進行分析。原代培養大鼠肝細胞受體數量為10,000個/細胞，Kd值為2pM； HepG2肝癌細胞受體數量分別為55,000個/細胞， Kd值為0.7pM; 人胎肝細胞受體數量為20,000個/細胞，Kd值為1.4pM。來源於其它組織的非肝源性細胞，如COS-7細胞、K562細胞、 Hep2細胞和 CHO細胞，與125I-rhHPO均無明顯的劑量效應關係。

只有未標記的HPO可競爭抑制125I-HPO與膜受體的結合，並呈劑量效應關係，在濃度為反應濃度的100倍左右時可發生完全競爭抑制，而胰島素、EGF和TGF-a卻不能競爭抑制125I-HPO與膜受體的結合。

在受體與配基已發生結合的HepG2細胞上，可見以細胞為中心簇集着直徑為1～2mm的黑色圓形顆粒，代表125I-rhHPO與膜受體結合後形成的複合物，表明HPO膜受體的存在。

結合反應後，加入交聯劑BS3，受體與125I-rhHPO複合物在SDS-PAGE上電泳，放射自顯影顯示分子量大約在90KDa左右，在結合反應時加入100倍未標記HPO，在90Kda無條帶出現，而加入EGF不影響複合物條帶的出現。已知HPO分子量，因此推測HPO受體的分子量大約為75KD。

HPO與肝再生關係密切，能特異刺激肝細胞增殖，促進肝細胞從G0/G1 進入S期，但有關HPO促肝細胞增殖的機理國際上尚未見報道。

通過125I標記的rhHPO，觀察125I-rhHPO與大鼠肝細胞、人胎肝細胞和肝癌細胞的結合，發現125I-HPO與肝細胞結合位點有劑量效應關係，且有飽和趨向及可逆性，即結合後若再加入大量未標記HPO，則125I-HPO與結合位點的結合下降；另外，其結合具有特異性，即加入胰島素、TGF-a和EGF，125I-hHPO與肝細胞膜上結合位點不受影響，結果證明肝細胞膜上的特異性位點可能就是HPO的受體，具有高度特異性，可逆性和飽和性。

通過受體結合實驗和結合競爭抑制實驗發現，肝源性細胞包括正常肝細胞（如原代培養大鼠肝細胞、人胎肝細胞和L02細胞等）與非正常肝細胞（如HepG2、HTC和SMMC7721肝癌細胞等）上均存在HPO受體，無種屬特異性，而來源於其它組織的非肝源性細胞，如COS-7細胞（腎）、K562細胞（血液）、 Hep2細胞（喉）和 CHO細胞（卵巢）等，與125I-rhHPO均無明顯的劑量效應關係，提示HPO受體的組織分佈和細胞定位具有特異性，這可能是HPO特異刺激肝細胞增殖的作用機理之一。

雖然原代大鼠肝細胞、肝癌細胞和人胎肝細胞上均有HPO的受體，但在數量和親和力上存在明顯的差異。原代大鼠肝細胞上受體的數量少，親和力低；肝癌細胞上受體的數量多，親和力高；胎肝細胞上受體數量和親和力介與兩者之間。胎肝含有豐富的造血幹/祖細胞和肝細胞的幹/祖細胞，它的正常生理發育需要生長因子定向誘導和分化。正常成年大鼠肝細胞可基本反應肝細胞在正常生理條件下的生長狀態，而肝癌細胞是反應肝細胞異常增殖的一種病理狀態。HPO受體在不同的生理發育階段和不同生理病理狀態下所表現的不同狀況，提示HPO可能是維繫肝細胞生長髮育最重要的生長因子之一。此作用通過肝細胞膜受體介導，是通過調節受體的數量和親和力發揮着HPO在肝細胞生長髮育中的重要作用。由於肝細胞和肝癌細胞自身可以產生HPO，其膜上又存在特異性受體，表明HPO可能通過自分泌循環方式調控肝細胞的生長髮育，受體數目與親和力的變化或HPO產生的異常可能是肝癌發生的機理之一。

首次在國際上充分確立HPO受體存在和特性基礎上，研究工作自然延伸到HPO受體—一種新的生長因子受體基因的分離上，我們利用HPO與其受體特異性結合原理，結合同位素示蹤，採用功能性篩選方法，進行了 HPO受體cDNA的分子克隆，獲得候選的HPO受體cDNA陽性克隆。

材料與方法

⒈人胎肝表達型質粒cDNA文庫

⒉ COS-7細胞培養

3．文庫的分離和篩選

⑴pool的建立

⑵pool質粒提取

⑶DNA轉染

⑷受體結合實驗

⑸ 陽性pool獲得

⑹亞pool的建立

⑺候選HPO受體cDNA陽性克隆獲得

HPO受體基因的分離和其它細胞因子受體基因的分離一樣，需要從基因庫中篩選，現多采用cDNA文庫進行篩選。HPO受體在肝細胞膜上表達量相當低，完成受體蛋白的分離和純化具有較高的難度，因此我們沿用大多數生長因子受體經典的克隆基因方法進行HPO受體的分子克隆。

設計以配基與受體結合實驗為基礎的文庫排列，結合矩陣篩選方法，可一定程度上克服此類篩選方法的繁瑣和耗時，減少工作量，不僅有效地解決質粒文庫擴增和保存的問題，也給以後的篩選帶來了極大的方便，並可重複用於多種基因克隆的篩選。

用已獲得的高標記和低失活的125I-rhHPO作為同位素配基進行受體結合實驗，以每個pool的CPM變化進行篩選，及亞pool陽性克隆的CPM值篩選結果。在第1輪篩選時陽性pool（約500個重組子）的CPM值可升高1.68 倍左右，第二輪篩選時陽性亞pool（約1-2個重組子）的CPM值可迅速升高14.5 倍左右，是一個非常有意義候選的HPO受體cDNA陽性克隆，為下一步獲得HPO受體cDNA提供重要的實驗依據。

前面我們已證實肝細胞中存在HPO自分泌循環，HPO促肝細胞增殖主要通過自分泌循環方式發揮作用，但具體的作用機理如何，是否存在旁分泌的作用方式尚不清楚，圍繞這些問題，結合細胞因子對靶細胞的最終效應是基因轉錄形式的改變，我們觀察了大鼠肝部分切除後72小時內與肝再生調控相關早期反應基因的表達，並研究了HPO在原代培養大鼠肝細胞中對這些基因的誘導表達

材料與方法

⒈動物模型

⒉大鼠肝細胞的分離和培養

⒊總RNA的提取

⒋PC3和Tec基因的克隆

⒌PC3和Tec cDNA探針的製備

⒍Northern 雜交

⒎PCR

以PH後1小時大鼠肝mRNA（1.0μg）為實驗（tester）mRNA，對照組mRNA為“驅使”（driver）RNA，經差減扣除後，取1/50產物連接入T載體，轉化大腸桿菌，並鑑定陽性重組子，隨機挑取52個克隆進行序列分析，經檢索，其中42株為已報道序列，其中32株已有報道與肝再生調控相關。表明該EST庫中富集了肝再生調控相關基因。42株已報道序列中含2株PC3和Tec基因克隆，與胰島素樣生長因子結合蛋白-1（IGFBP-1）基因出現頻率相同，IGBP-1是一種與肝再生密切相關的早期反應基因，因此提示PC3和Tec基因可能與肝再生密切相關。

為驗證PC3和Tec基因的表達是否與肝再生相關，我們首先採用點雜交分析了2/3PH後72h內PC3和Tec mRNA表達情況，提示2/3PH後PC3和Tec基因的表達增加，進而Northern雜交證實了這一結果，正常肝組織中PC3和Tec mRNA有低丰度表達，2/3PH後1-2h表達迅速增加7-10倍，以後mRNA水平恢復到正常肝組織水平。IGFBP-1在2/3肝部分切除後的表達也迅速增加，其表達時相與報道一致。

在原代無血清培養肝細胞中，c-fos,LRF-1的表達很低，加入HPO和EGF後其表達迅速增加，表達高峯出現於HPO和EGF刺激後的0.5-2h之間，2h後c-fos和LRF-1表達水平基本恢復到刺激前的水平，；以HPO刺激肝細胞後不同時間點RNA反轉錄產物為模板進行PCR，分別取18、23、28、33循環數擴增產物電泳成像，以半定量的方式檢測HPO對PC3和Tec基因誘導表達的情況。在原代無血清培養肝細胞中，PC3和Tec基因呈低水平表達表達（28循環後可見特異表達帶），HPO刺激後其表達迅速增加，高峯在HPO刺激後的0.5-2h之間（23循環後可見特異表達帶），0.5-2h表達迅速增加3-5倍，4h後恢復刺激前的水平，蛋白抑制劑CXH不能抑制PC3和Tec基因的誘導表達，提示PC3和Tec基因的誘導表達是在新的蛋白質合成之前，表明它們是瞬時早期反應基因。

同其它細胞增殖一樣，c-fos,c-jun和c-myc等原癌基因也是肝細胞增殖的最早分子學特徵，被認為是肝再生啓動的標誌，而LRF-1和IGFBP-1是特異的肝再生相關瞬時早期反應基因。PC3是1991年Bradbury從PC12細胞（嗜鉻細胞瘤株） cDNA文庫中篩選出一種可被NGF特異性誘導的分泌型蛋白，在神經原發育過程中，PC3的表達有嚴格的空間和時間的限制，具有抗增殖和促分化的作用。超表達PC3基因的NIH3T3細胞生長受到明顯的抑制， PC3被認為是一種NGF特異誘導產生的具有生長抑制作用的瞬時早期反應基因。Tec編碼酪氨酸激酶，參與多種細胞因子的信號轉導，已有研究證實其在造血細胞的生長和或分化中發揮重要的作用。

我們以大鼠2/3肝部分切除1小時再生肝為模型，通過RDA進行細胞增殖調控基因的研究中獲得較高丰度的PC3和Tec基因克隆，提示PC3和Tec基因的表達很可能與肝再生調控相關。鑑於國內外尚無PC3和Tec基因與肝再生相關的報道，我們觀察了大鼠肝部分切除後72小時內PC3和Tec基因的表達，並研究了HPO在原代培養大鼠肝細胞中對PC3和Tec基因的誘導表達，證實PC3和Tec是一種與肝再生密切相關的瞬時早期反應基因。

肝再生早期反應基因的激活由升高於閾值的循環生長因子啓動，PH後即刻出現的快速代謝適應使肝細胞對肝內外生長因子產生反應，並使大量反應性基因激活，HPO作為特異刺激肝細胞增殖的生長因子，在肝再生啓動及其進程中發揮着舉足輕重的作用，它的表達水平改變，必定伴隨着大量反應性基因激活。c-fos和LRF-1是肝再生相關的瞬時早期反應基因的典型代表，在絲裂原刺激下，c-fos和LRF-1可被快速誘導，它們和Jun蛋白家族成員一起形成不同的異二聚體調節轉錄激活蛋白（AP-1）的活性，從而發揮不同甚至相反的轉錄激活效應。我們在體外和體內實驗中發現，PC3和Tec與c-fos及LRF-1的誘導表達峯值相互重疊，提示PC3和Tec與c-fos和LRF-1可能在肝再生中有某些相似的轉錄調控機理，HPO對這些早期基因的激活，證實HPO特異刺激肝細胞增殖的作用機理是通過調控肝再生相關早期反應基因來實現的，這與HGF、EGF和TGF-α等生長因子對早期反應基因誘導情況基本類似。

PC3基因編碼蛋白是一種分泌蛋白，與某些肝再生相關的瞬時早期反應基因如IGFBP-1等相似，可能以一種旁分泌作用方式作用於肝非實質細胞，影響細胞因子的表達，間接發揮對肝細胞增殖分化的調節，也提示HPO作用機理中不僅有自分泌作用方式，而且很可能存在一種旁分泌作用方式；此外，PC3基因具有明顯的抗增殖和促分化作用，在肝再生早期機體應以表達促增殖基因為主，因此，此時PC3基因的表達可能是作為一種重要的肝組織重建過程中各種細胞定向分化的正性調節劑起作用的，而其抗增殖的作用是否與另一肝再生重要負性調節細胞因子TGF-b有關需進一步研究。Tec蛋白與細胞因子受體的酪氨酸激酶蛋白不同，是另一種胞內的酪氨酸激酶蛋白，是細胞因子信號轉導途徑過程中另一個重要靶分子，可與Jak2激酶相互作用，共同調節細胞因子誘導的c-fos 的轉錄激活。HPO對Tec基因的快速誘導表達，提示HPO信號轉導的多重性，對肝細胞的生長和/或分化具有重要作用，但具體機理尚不清楚。深入研究PC3和Tec基因與肝再生的關係，將有助於闡明肝再生時細胞增殖和分化的分子機理。

⒈rhHPO 在體外對原代培養大鼠肝細胞、人胎肝細胞和肝癌細胞具有刺激增殖的作用，而對非肝源性細胞無刺激作用，表明其作用具有相對器官組織特異性。

⒉採用氯胺-T法對rhHPO進行放射碘標記，獲得高標記和低失活的125I-rhHPO。

⒊通過受體結合和特異性競爭抑制實驗及Scatchard分析，首次證實原代培養大鼠肝細胞、人胎肝細胞和肝癌細胞存在HPO受體，且存在數量上和親和力的差異。受體分子量約75Kda。

⒋證實HPO促肝細胞增殖作用與肝細胞表面此特異性膜受體有關，其受體的組織分佈和細胞定位具有特異性，可能是HPO特異刺激肝細胞增殖的作用機理之一。

⒌採用功能性篩選方法篩選人胎肝cDNA文庫，獲得候選的HPO受體cDNA陽性克隆。

⒍HPO在原代培養大鼠肝細胞體系中可迅速誘導瞬時早期反應基因的表達，可能是HPO促肝細胞增殖的分子作用機理之一。

⒎首次證實PC3和Tec基因是一種與肝再生調控密切相關的早期反應基因。

⒏肝細胞和肝癌細胞具有刺激增殖的作用