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ABC法
鎖定
- 中文名
- ABC法
- 全 稱
- ABC免疫酶染色法
- 又 稱
- 卵白素-生物素-酶複合物染色法
- 原 理
- 藉助卵白素與生物素的天然親和性
ABC法主要材料
使用的主要材料:PBS;T-ris-HCl緩衝液;底物溶液;ABC試劑盒;小鼠(兔)特異性抗體;蓋片染色缸。濕盒,顯微鏡等。
ABC法染色步驟
染色的基本步驟:
1:細胞準備。將7mm x 22mm蓋片置於培養瓶中,加入對數生長期細胞懸液於培養瓶中,待細胞長成單層,取出蓋片,用PBS洗2次;懸浮生長的細胞離心後用PBS離心洗滌2次,製成細胞塗片。
2:細胞固定。用醋酸/甲醇或95%酒精固定20-30min。
3:取已固定的細胞蓋片,用PBS洗5min,浸入37℃的0.75%H2O2-PBS中3min,以阻斷內源性過氧化物酶。
4:PBS振洗2次,每次3min。
5:滴加正常馬血清,在濕盒內,37℃保温30min,以消除非特異性染色。
6:棄去正常馬血清,滴加小鼠特異性抗體,在濕盒呢37℃保温30-60min或4℃過夜。
7:PBS振洗2次,每次3min。滴加生物素化馬抗小鼠IgG,在濕盒內37℃ 30min。
8:PBS振洗3次,每次3min,滴加ABC試劑,在在濕盒內37℃ 30min.
9:PBS振洗2次,THB振洗1次,每次3min,浸入新鮮配製的底物溶液,在室温下置暗處10-20min。
10:自來水洗5min
11:細胞核染色。浸入蘇木精染液染色2min,自來水洗,迅速過鹽酸酒精溶液,自來水洗,過氨水溶液,自來水洗。
12:逐級脱水。過70%酒精1次,95%酒精2次,無水乙醇3次,每次1min。
13:透明,過二甲苯溶液3次,每次1min。
14:將有細胞的面向下,用中性樹脂封片。
此種染色方法應設置陽性對照、陰性對照、空白對照及抑制試驗,以排除非特異性染色。要控制顯色反應時間,以陽性反應着色最強,而有的是剛開始着色為佳。滴加抗體的量要適當,防止液體乾涸。空白對照用PBS做一抗。抑制試驗是將待檢標本與未標記特異性抗體反應後,再用自己標記的特異性抗體進行染色,結果陽性強度減弱或轉為陰性。
此法染色結果在光鏡下觀察,陽性部分呈棕褐色。
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