鳥槍法

鳥槍法是直接從生物細胞基因組中獲取目的基因最常用的方法。它用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，使供體細胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分別在各個受體細胞中大量複製，從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來 ^[3]  。此方法操作簡便，但工作量大。

它的好處是速度快，在很短的時間裏就能拿到生物細胞基因組(例如人類基因組95% 的序列)。該法的思路獨特，好像樹林裏停了一大羣鳥，很多人亂槍射擊，在很短的時間內，就可以將林子中的大部分鳥打中。鳥槍法又有點類似人們玩的拼圖遊戲。拼圖遊戲是將一個完整的畫面分成雜亂無章的碎塊,然後重新拼裝復原。而“鳥槍法”則是先將整個基因組打亂，切成隨機碎片，然後測定每個小片段序列，最終利用計算機對這些切片進行排序和組裝，並確定它們在基因組中的正確位置。

“鳥槍法”是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合，將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。

這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。可以説這是利用“溜散彈射擊”原理去“命中”某個基因。由於目的基因在整個基因組中太少太小，在相當程度上還得靠“碰運氣”，所以人們稱這個方法為“鳥槍法”或“散彈槍”實驗法。

按照常規方法從作為供體的生物細胞中分離純化其染色體DNA，在一般條件下，由於分離純化操作中的物理剪切作用，製備出的染色體DNA片段平均大小在10～-200kb左右。然後將染色體DNA用下列方法切成片段，以便與載體分子進行體外重組 ^[1]  。

(1)機械切割。供體染色體DNA可用機械方法(如超聲波處理等)隨機切割成雙鏈平頭片段，採取合適的超聲波處理強度和時間可將切割的DNA片段控制在一定範圍內，其上限為載體的最大裝載量，而下限應大於目的基因的長度，否則無法在一個重組克隆中獲得完整的目的基因。一胺來説，原核生物的基因長度大都在2kb以內，真核生物的基因長度變化很大，最大的基因可達1001kb以上，因而將外源DNA片段處理成略小於載體裝載量上限的長度始終是正確的，因為每個重組克降中所含的外源DNA片段越大，後續選的規模就越小。當染色體DNA上目的基因區域的限制性酶切圖譜未知時，機被切割是製備待克隆DNA片段的首選方法，但由於這些DNA片段具有隨機平頭末端，因此必須插入載體DNA的平頭限制性酶切位點上，而且克隆的外源DNA片段很難完整地從重組分子上卸下。

(2)限制性內切酶部分解。採用識別序列為四破基對的限制性內切酶(如MbolSaa3A、Alal等)部分降解染色體DNA，也可獲得大片段的DNA分子。由於這些限制性內切酶的識別順序在任何生物基因組中頻繁出現，因此只要採取合適的部分酶解條件同樣可以獲得一定長度的DNA隨機片段，而且經部分酶解獲得的DNA片段具有黏性末端，可以直接與載體分子拼接。

(3)特定限制性內切酶全酶解。如果染色體DNA中目的基因的兩側擁有已知的限制性內切酶識別位點，而且兩者之間距離不超過載體裝載量的上限，那麼用這一種(或兩種)限制性內切酶全酶解染色體DNA片段可能更為有利，所產生的DNA片段呈非隨機性，在某些程度上可以簡化後續的重組和篩選操作。同時，重組分子可用相同的限制性內切酶完全切下插入片段，這使得利用限制性酶切圖譜法直接篩選目的重組子成為可能。

根據外源DNA片段的末端性質及大小確定克降載體，鳥槍法一般選擇質粒或入-DNA作為克隆載體，受體細胞大多選擇大腸桿菌，只有當後續篩選必須採用外源基因表達產物檢測法時才選擇那些能使外源基因表達的相應受體系統 ^[1]  。

從眾多的鳥槍法克隆中快速檢出目的重組子的最有效手段是菌落(菌斑)原位雜交法或外源基因產物功能檢測法，前者需要理想的探針，後者則依賴於簡便篩選型的建立。如前所述，若克隆澱粉酶、蛋白或抗生素抗性基因，利用外源基因產物功能檢測法篩選目的重組子是最理想的選擇。在既無探針又難以建立快速篩選模型的情況下，也可採用限制性酶切圖譜法對所獲重組克隆進行分批篩選。例如，已知目的基因位於2.8kb的 ECORI DNA片段中，可用 ECORI分別酶解所有的重組分子，初步確定含2.8kb限制性插入片段的重組克隆，然後再根據目的基因內部的特徵性限制性酶切位點進行第二輪酶切篩選，最終找到目的重組子 ^[1]  。

在絕大多數情況下，利用鳥槍法獲得的目的重組子只是包含目的基因的DNA片段，必須通過次級克隆在已克隆的DNA片段上準確定位目的基因，然後對目的基因進行序列分析，搜尋其編碼序列以及可能存在的表退染色體DNA調控序列。鳥槍法克隆目的基因的工作量之大是可想而知的，對目的基因及其編碼產物的性質瞭解得越詳盡，工作量越小 ^[1]  。

“鳥槍法”最初主要用於測定微生物基因組序列。近年來，利用改進的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測序工作，證明了它在測定大基因組上的可行性和有效性 ^[4]  。

2001年7月，我國雜交水稻基因組計劃正式展開，首先以雜交水稻的父本即純種秈稻93-11為研究對象。與國際水稻基因組計劃不同，這一研究採用全基因組“鳥槍法”策略進行測序 ^[4]  。

“鳥槍法”優點是速度快，簡單易行，成本較低 ^[4]  。但用它來測序，最終排序結果的拼接組裝不太容易。中國科學家設計出了一種序列組裝軟件，能有效克服“鳥槍法”全基因組測序組裝過程中的困難 ^[4]  。

在研究中，他們首先在整個水稻基因組上生成許多已知長度的DNA（脱氧核糖核酸）切片，然後使它們按DNA序列的重合區域進行排列。這些切片數量足以覆蓋水稻基因組4次。科學家們接着確定每個切片的鹼基對序列，並用計算機程序將其組裝成更長的片段，然後將這些片段排序、裝配成10萬多個被稱為支架的更大組件 ^[4]  。

他們設計出的軟件重點是通過支架水平上的接近來進行組裝，並採取了獨特的重複序列處理算法，可識別並暫時屏蔽佔水稻基因組約40%的重複序列。這樣做的好處是既能減少計算量，又最大限度降低了錯誤拼接的可能性。

美國珀杜大學植物遺傳學家貝內特澤恩評價説，中國科學家的水稻基因組計劃，“提供了一個有關鳥槍測序法速度和效率的極好範例” ^[4]  。

真核生物在基因表達時，結構基因中的內含子不能指導蛋白質的合成。所以真核生物的目的基因不能用“鳥槍法”獲得。真核生物基因大都由有編碼功能的序列——外顯子和無編碼功能的序列——內含子，兩者比例為1：4構成。鳥槍克隆法在基因組DNA文庫中篩選到的目的基因，與染色體中的天然基因是一樣的，含有內含子，在結構基因兩端的連接區還有轉錄調控序列片段，即調節基因。這樣的基因可供基因表達的調控分析。因為有內含子的存在，這樣獲得的結構基因不宜在原核宿主組織中表達。所以，要獲得真核生物的目的基因，準確的説要獲得真核生物目的基因的編碼序列，不宜用鳥槍法。